抗腫瘤新藥德氮吡格的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、癌癥對(duì)人類的威脅日益嚴(yán)重，而人們?cè)诠タ税┌Y的征途中，卻舉步維艱。目前用于臨床的抗腫瘤藥物存在的主要問題是：選擇性差，對(duì)實(shí)體瘤作用不佳，易產(chǎn)生多藥耐藥性等。 本課題研究的德氮吡格(Tetrazanbigen，TNBG)是自主創(chuàng)新設(shè)計(jì)合成的氮雜甾烷類化合物。經(jīng)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明，德氮吡格具有良好的抗腫瘤作用，能顯著延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存期，且無交叉耐藥性。在德氮吡格對(duì)人肝癌細(xì)胞QGY-7701的實(shí)驗(yàn)中，觀察到德氮吡格引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量脂滴

2、聚積的特殊現(xiàn)象；基因芯片篩選出的眾多差異基因中以脂代謝相關(guān)基因變化最顯著。由此，我們提出德氮吡格可能通過影響腫瘤細(xì)胞的脂代謝達(dá)到抗腫瘤的目的，但其分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本文擬采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，比較德氮吡格給藥前后人肝癌細(xì)胞QGY-7701的蛋白質(zhì)差異，探索德氮吡格影響腫瘤細(xì)胞脂代謝產(chǎn)生脂質(zhì)聚積的特殊現(xiàn)象，以及抗腫瘤作用的機(jī)制，望能找到德氮吡格作用的靶點(diǎn)，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供新思路。 本文完成的主要工作和結(jié)論如下

3、： 1、建立了人肝癌細(xì)胞QGY-7701的細(xì)胞漿、細(xì)胞膜、細(xì)胞核蛋白質(zhì)組雙向電泳分離技術(shù)。采用亞細(xì)胞抽提試劑盒提取各亞細(xì)胞組分，以不同的方法除鹽濃縮蛋白質(zhì)樣品，然后，分別采用兩種不同的水化上樣緩沖液重懸樣品，進(jìn)行雙向凝膠電泳。結(jié)果顯示：聯(lián)合使用丙酮、三氯乙酸的除鹽效果好，樣品損失少；采用上樣緩沖液Ⅱ(7mol/L尿素+2mol/L硫脲+4％CHAPS+40mmol/L Tris+65mmol/L DTT+2％兩性電解質(zhì))有利于蛋

4、白的溶解，獲得更多的蛋白信息，檢出的細(xì)胞漿蛋白點(diǎn)可達(dá)995±53，細(xì)胞膜蛋白點(diǎn)可達(dá)1035±58，細(xì)胞核蛋白點(diǎn)可達(dá)893±45。 2、利用上述建立的雙向電泳技術(shù)，分離德氮吡格(4μg/mL)給藥前后的人肝癌細(xì)胞QGY-7701的細(xì)胞漿、細(xì)胞膜、細(xì)胞核蛋白，用PDQuest(7.4.0)軟件進(jìn)行比較分析、尋找二倍以上的差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示：德氮吡格作用于人肝癌細(xì)胞QGY-7701 72h后，細(xì)胞漿的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有56個(gè)，細(xì)胞膜

5、的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有65個(gè)，細(xì)胞核的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有34個(gè)，共計(jì)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有155個(gè)。 3、結(jié)合基因芯片，從155個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中篩選出14個(gè)細(xì)胞漿蛋白點(diǎn)、25個(gè)細(xì)胞膜蛋白點(diǎn)、9個(gè)細(xì)胞核蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，MS-Fit數(shù)據(jù)庫鑒定。 結(jié)果鑒定出33個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中包括與脂質(zhì)合成有關(guān)的11個(gè)蛋白，與脂質(zhì)降解有關(guān)的4個(gè)蛋白和與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的3個(gè)蛋白。在這些差異蛋白中與脂代謝有關(guān)的蛋白變化最明顯，

6、蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果與基因芯片研究結(jié)果一致。 4、采用Western blot方法，對(duì)變化顯著的脂代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游調(diào)控因子SREBP-1和脂質(zhì)轉(zhuǎn)出途徑關(guān)鍵蛋白MTTP進(jìn)行研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：4gg/mL德氮吡格作用于人肝癌細(xì)胞QGY-7701 72h后，SREBP-1的表達(dá)增加，MTTP的表達(dá)降低，蛋白水平的驗(yàn)證結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果一致。從蛋白質(zhì)水平上，這進(jìn)一步支持德氮吡格抗腫瘤作用的主要機(jī)制是通過干擾腫

7、瘤細(xì)胞的脂代謝。 5、通過上述差異蛋白的功能分析可知，德氮吡格對(duì)腫瘤細(xì)胞脂代謝調(diào)控所導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚積可能通過以下幾條途徑： ①SREBP-2調(diào)控的膽固醇合成增加途徑； ②SREBP-1調(diào)控的甘油三酯合成增加途徑； ③脂質(zhì)分解途徑被抑制； ④MTTP調(diào)控的脂質(zhì)轉(zhuǎn)出途徑被抑制。 由此可知，德氮吡格除通過SREBPs途徑增加膽固醇和甘油三酯合成外，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚積主要原因可能