紫色LED光照射姜黃素對鼻咽癌細胞殺傷作用及機制的初步探討.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma)是一種好發(fā)于我國南部地區(qū)的惡性腫瘤，具有明顯的地域性，它的發(fā)生和地方飲食、環(huán)境、免疫以及病毒感染等多種因素有關(guān)。針對鼻咽癌的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，鼻咽癌的放療效果較好，但是復發(fā)率和遠期轉(zhuǎn)移率較高。近些年采用了新的治療方法如生物干預(yù)、免疫調(diào)節(jié)以及中醫(yī)藥治療等綜合治療，光動力療法就是其中之一。
　　 光動力療法(photo dynamic therapy，PDT)是

2、一種新興的治療腫瘤的手段，它的作用原理是利用光敏劑可以特定地聚集在腫瘤組織，而且在一定波長的光的激發(fā)下，發(fā)生光化學反應(yīng)和能量轉(zhuǎn)移，氧存在的條件下可以生成大量的活性氧基團(reactive oxygen species，ROS)，損傷細胞的結(jié)構(gòu)功能，導致腫瘤細胞的凋亡和壞死，從而達到治療腫瘤的作用。由于光敏劑和腫瘤的親和力高，因此PDT治療具有一定的特異性，對周邊正常組織的損傷較小。但是畢竟屬于局部治療，治療范圍有限，采用的光源主要是大型

3、的激光器，而且光敏劑價格昂貴，同時還會對人體產(chǎn)生一定的光毒性，給人們的生活帶來不便。基于以上種種原因，研究人員開始從光源，光敏劑，聯(lián)合作用三方面進行光動力療法的改進研究。
　　 傳統(tǒng)的化療藥物雖然有較顯著的抗腫瘤效應(yīng)但同時也會對機體產(chǎn)生一定的副反應(yīng)，現(xiàn)在很多研究人員致力于從植物中提取低毒的抗腫瘤藥物，姜黃素就是其一。姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種植物多酚，具有顯著的抗炎、抗氧化以及抗腫瘤效應(yīng)，并且毒副作用少。姜黃素除了具有抗腫

4、瘤效應(yīng)外還具有光敏化效應(yīng)，在光照的情況下容易發(fā)生變構(gòu)和分解，其可見光的激發(fā)波長為425nm。有極少數(shù)研究證實酚類物質(zhì)經(jīng)日光照射后可以發(fā)揮較強的抗癌作用，但研究的還不深入?；诮S素光敏化特性和目前的研究現(xiàn)狀，將姜黃素作為光敏劑用于PDT治療中，既有可能發(fā)揮姜黃素本身的抗癌效應(yīng)同時發(fā)揮其光敏化效應(yīng)，可避免傳統(tǒng)光敏劑的一些毒副作用。本課題擬采用紫色LED光作為激發(fā)光，觀察其照射姜黃素對兩種鼻咽癌細胞的殺傷效應(yīng)，并初步探討紫色LED光照射姜黃

5、素抑制鼻咽癌細胞生長的可能機制。
　　 方法：
　　 實驗采用兩種鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2，分為對照組、單獨姜黃素孵育2h組(姜黃素濃度為5、10、20、40、80和160μM)和紫色LED光照射姜黃素組(采用的光能量密度分別為0.1、0.2、0.4和0.6J/cm2)。MTT檢測各組處理24h后對兩種細胞的殺傷效應(yīng)。然后用能量密度為0.2J/cm2的紫色LED光照射40μM姜黃素，采用HE染色光鏡觀察細胞形態(tài)學變

6、化；接著采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡定性觀察和PI流式細胞儀定量檢測在不同處理后24h鼻咽癌細胞的凋亡情況，同時檢測各處理組細胞的周期分布。隨后利用DCFH-DA探針標記細胞，檢測40μM姜黃素處理后不同時間點鼻咽癌細胞內(nèi)活性氧的生成變化(時間點為30、60和120min)；并檢測不同能量密度的紫色LED光照射姜黃素后(姜黃素孵育2h)對鼻咽癌細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)量的影響。最后加入不同的活性氧抑制劑(NAC、疊氮鈉和甘露醇)檢測

7、鼻咽癌細胞活性的改變。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差的形式表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.單獨姜黃素作用后CNE1和CNE2的IC50值分別為164.11μM和190.97μM；經(jīng)0.2J/cm2紫色LED光照射后對鼻咽癌處理，IC50值分別為47.7μM和55.6μM。采用40μM的姜黃素孵育經(jīng)0.1、0.2、0.4和0.6J/cm2紫色LED

8、光照射后對鼻咽癌細胞的殺傷效應(yīng)會隨著紫光能量密度的增強而增大。
　　 2.各處理組細胞采用熒光探針和流式檢測細胞的凋亡情況：
　　 (1)采用Hoechst33342染色細胞核觀察到單獨姜黃素處理后兩種鼻咽癌細胞的密度有所下降，核部分凝集，發(fā)出明亮的藍色熒光；但是經(jīng)0.2J/cm2的紫色LED光照射姜黃素后可看到大量的鼻咽癌細胞核碎裂、濃染和凝集。
　　 (2)PI染色進行流式分析發(fā)現(xiàn)單獨姜黃素和紫色LED光照射

9、姜黃素處理組細胞的凋亡率不同，CNE1由6.65％升為36.55％；同時CNE2也由2.55％上升到25.53％。
　　 3.在CNE1細胞中姜黃素處理后細胞發(fā)生了G2/M和S期阻滯，由對照的6.25％和13.35％變?yōu)?5.5％和28.9％，紫色LED光照射姜黃素后細胞G2/M細胞比例為10.1％，而S期細胞比例由28.9％達到了51.85％；CNE2細胞中單獨姜黃素處理后細胞都發(fā)生了S期阻滯，由對照的28.9％變?yōu)?6.65

10、％，紫色LED光照射姜黃素后則升到56.55％，同時G2/M期的細胞比例也達到了22.85％，和CNE1相比G2/M期阻滯明顯。
　　 4.NPC胞內(nèi)活性氧的水平從30min直到120min呈現(xiàn)上漲的趨勢，CNE1細胞內(nèi)的ROS從10.5逐漸增長到46.2；CNE2細胞內(nèi)的ROS也由10.1升為56.5。
　　 5.紫色LED光照射姜黃素后CNE1細胞活性氧水平顯著升高，0.1、0.2和0.4J/cm2紫色LED光照射后

11、的活性氧分別為49.8、80.7和392.8；同樣類似的結(jié)果也發(fā)生在CNE2，對應(yīng)的光能量密度照射產(chǎn)生的活性氧為136.1、161.2和308.1。
　　 6.在紫色LED光照射姜黃素處理前加入活性氧抑制劑后紫色LED光照射后CNE1的細胞抑制率由26.8％分別降低為23.36％、24.34％和20.25％；同樣CNE2的抑制率也從22.36％減少到18.69％、21.4％和15.6％。
　　 結(jié)論：
　　 1.