PCR-SSP方法研究武漢人群HLA-A-02多態(tài)性及其常見(jiàn)亞型基因的克隆.pdf

1、HLA-A*02不同亞型在提呈抗原肽及T細(xì)胞識(shí)別方面的功能差異一直是研究的熱點(diǎn)，而且在臨床器官移植過(guò)程中HLA-A*02亞型不匹配引起的強(qiáng)烈的同種反應(yīng)也越來(lái)越受到重視。因此在腫瘤免疫學(xué)方法治療、同種反應(yīng)研究中常需要對(duì)HLA-A*02亞型及其功能加以分析。
　　 為了進(jìn)一步研究HLA-A*02不同亞型在提呈抗原肽及T細(xì)胞識(shí)別方面的功能，我們建立了一種通過(guò)19條引物組成的15對(duì)特異引物組合，能夠快速檢測(cè)出17個(gè)HLA-A*02亞型巢

2、式聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）HLA-A*02等位基因分型方法，并調(diào)查了該等位基因在武漢人群的分布情況。同時(shí)在檢測(cè)亞型的基礎(chǔ)上克隆了HLA-A*0206基因及構(gòu)建了HLA-A*0207真核表達(dá)載體，本研究主要內(nèi)容如下：
　　 目的：①建立一種能簡(jiǎn)易、快速檢測(cè)出HLA-A*02亞型分型方法及調(diào)查武漢地區(qū)人群該等位基因的分布；②克隆HLA-A*0206基因，并構(gòu)建HLA-A*0207真核表達(dá)載體。
　　 方

3、法：①本研究從武漢健康志愿者獻(xiàn)血人員中經(jīng)第一輪PCR篩選HLA-A*02陽(yáng)性個(gè)體，然后通過(guò)具有較高特異性第二輪PCR-SSP進(jìn)行HLA-A*02亞型等位基因分析。此外，由于A*0209和A*0215N的多態(tài)性位點(diǎn)在第四外顯子，第一輪PCR即可進(jìn)行亞型分型，不需兩輪PCR分型。②為了驗(yàn)證我們方法的可靠性，采用T2細(xì)胞（A*0201）作為陽(yáng)性對(duì)照，取部分標(biāo)本用抗HLA-A*02特異性單抗BB7.2進(jìn)行血清學(xué)流式細(xì)胞（FACS）檢測(cè)，并送PC

4、R產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。③根據(jù)亞型分型結(jié)果，采用RT-PCR方法克隆HLA-A*0206基因，并構(gòu)建HLA-A*0207真核表達(dá)載體，挑取單克隆細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒酶切、測(cè)序鑒定。
　　 結(jié)果：①?gòu)?54例武漢健康志愿者獻(xiàn)血人員中經(jīng)第一輪PCR篩選78例HLA-A*02陽(yáng)性個(gè)體，血清學(xué)FACS檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果也都為陽(yáng)性；②從HLA-A*02陽(yáng)性個(gè)體中共檢測(cè)到5個(gè)A*02等位基因，其中A*0201基因頻率最高（15.7%）；其余依次為A*0

5、207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)；亞型特異性PCR-SSP分型的結(jié)果與測(cè)序分析結(jié)果也完全一致；③克隆的HLA-A*0206基因及構(gòu)建的HLA-A*0207真核表達(dá)載體，分別挑單克隆測(cè)序結(jié)果均與Genebank提供序列一致，說(shuō)明HLA-A*0206基因克隆及HLA-A*0207真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：我們成功地建立了一種能簡(jiǎn)易快速地檢測(cè)出占有A*02

6、頻率99%以上17種亞型的巢式PCR-SSP分型方法，通過(guò)該方法檢測(cè)到武漢地區(qū)HLA-A*02分布具有高度多態(tài)性,其中A*0201基因頻率最高（15.7%）；其余依次為A*0207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)。在分型的基礎(chǔ)上克隆了包含兩端部分非編碼區(qū)（UTR）的HLA-A*0206等位基因及成功構(gòu)建了HLA-A*0207真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究HLA-A*02各亞型功