惡性瘧原蟲175KDa紅細(xì)胞結(jié)合抗原與其受體相互作用分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景與目的:瘧疾是危害人類健康的蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶一些發(fā)展中國家。近年來，由于瘧原蟲抗藥性和蚊媒耐藥性的日益增強(qiáng)和廣泛擴(kuò)散，加之一些現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)和社會因素的影響，使瘧疾(尤其是惡性瘧原蟲)的流行有復(fù)燃趨勢，急性感染病人越來越多，而可供選擇的廉價、有效的化療藥物越來越少，從而使瘧疾的防治面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。 自上世紀(jì)50年代以來，我國在中醫(yī)藥防治瘧疾方面取得了豐碩的成果，尤其是應(yīng)用青蒿素治療惡性瘧疾取得優(yōu)良療效的研究。為

2、中醫(yī)藥抗瘧鋪開了光明的前景。當(dāng)今，以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)正以其巨大的活力推動著各個生命學(xué)科的發(fā)展。研究中藥在分子水平的調(diào)控作用是近年來中醫(yī)學(xué)界的重點和熱點。因此從瘧疾的分子作用機(jī)制著手來研究中藥作用機(jī)制，將有助于從更深的層次、更本質(zhì)地揭示中藥的機(jī)理。本實驗主要探討EBA-175與其受體之間的分子作用機(jī)制，從基因水平闡明截瘧類中藥對阻斷惡性瘧原蟲入侵的可能作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治瘧疾的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3、 方法:采用PCR的方法從惡性瘧原蟲基因組DNA中擴(kuò)增出EBA-175Ⅱ區(qū)F2結(jié)構(gòu)域856-1848bp的基因，TA克隆入PMD18-T載體，測序并分析，然后利用亞克隆技術(shù)將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET23a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET23a-EBA。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，篩選強(qiáng)表達(dá)株，并通過優(yōu)化表達(dá)條件以求最佳表達(dá)；大量誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，通過制備電泳法純化重組蛋白，

4、并對其進(jìn)行Western-blot分析，分析其抗原性。以純化后的EBA-175重組蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備McAb，間接ELISA篩選分泌高滴度McAb的雜交瘤細(xì)胞株，測定其免疫球蛋白亞類及其效價，ELISA、Westernblot試驗分析其特異性。此過程中設(shè)氯喹、氯喹加黃芪、氯喹加刺五加干預(yù)組，觀察藥物作用對動物免疫力的影響。再以EBA-175重組蛋白為靶，采用親和篩選法對噬菌體隨機(jī)十二肽庫和環(huán)七肽庫進(jìn)行三輪篩選，

5、通過ELISA、競爭抑制試驗、Dot-ELISA及Westernblot等方法鑒定獲得的噬菌體短肽與EBA-175之間的結(jié)合特性。對陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，推導(dǎo)其氨基酸序列并與GPA氨基酸全序列進(jìn)行了同源性比較。以獲得與EBA-175Ⅱ區(qū)F2結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的噬菌體陽性克隆，并根據(jù)其核酸序列歸納EBA-175與受體相互識別的活性核區(qū)。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了重組EBA-175Ⅱ區(qū)F2結(jié)構(gòu)域基因表達(dá)載體。 2、

6、獲得了高純度的EBA-175重組蛋白，經(jīng)分析其具有較好的免疫原性。 3、獲得了能穩(wěn)定分泌高滴度和高特異性抗EBA-175McAb的雜交瘤細(xì)胞。 4、黃芪、刺五加分別與氯喹合并可以提高免疫功能，促進(jìn)抗體形成。 5、陽性噬菌體表達(dá)的短肽是EBA-175所識別的模擬表位，與GPA同源性較高的幾位氨基酸可能對EBA-175與GPA的結(jié)合起重要作用。 6、為中醫(yī)藥復(fù)方研究提供了新的思路，為中藥在基因水平上的作用找到