惡性瘧原蟲動力素相似蛋白1的功能研究.pdf

1、瘧疾是目前地球上對人類危害最嚴重的蚊媒寄生原蟲病。全世界每年有3至5億人受到瘧原蟲感染，二百至三百余萬人死于惡性瘧疾，其中80％是五歲以下兒童。瘧原蟲是瘧疾的病原體，寄生于人體的瘧原蟲共有4種，惡性瘧原蟲是其中最致命的一種。由于惡性瘧原蟲對現(xiàn)有藥物的抗藥性不斷出現(xiàn)和蔓延，蚊媒對殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生等因素影響，加上迄今尚無有效的瘧疾疫苗出現(xiàn)，致使對瘧疾的控制成為世界性的大難題之一。 對瘧疾的防治是多種多樣的，可以針對不同的發(fā)育階段和

2、傳播環(huán)節(jié)采取不同的措施。目前公認最有發(fā)展前景的策略包括：1)能夠有效抑制瘧原蟲的某一特殊生命過程的藥物；2)具有預(yù)防及治療作用的疫苗。 惡性瘧原蟲動力素相似蛋白1(Plasmodium falciparum dynamin like protein 1)是本實驗篩選出的新蟲源基因，前期工作證明其功能具有多樣性，可能在內(nèi)吞通路和分泌通路中具有重要的作用，并且是維持惡性瘧原蟲生存的重要基因。為了更深入地了解其功能，本文嘗試使用基因敲

3、除和特異性抑制劑等技術(shù)手段，進行進一步的研究。 首先，構(gòu)建了用于全長敲除和C端敲除的雙交換敲除載體，經(jīng)電脈沖轉(zhuǎn)染方法，獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。隨后利用有限稀釋法培養(yǎng)了單克隆。遺傳實驗證明沒有得到預(yù)期的全長敲除的惡性瘧原蟲蟲株，但是有發(fā)生單交換的蟲體存在。C末端敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子由于時間關(guān)系，沒有及時單克隆化并進行分析，對C末端敲除后的效果尚待觀察。 其次，本研究中嘗試了p.f dynamin like protein1蛋白在原

4、核和真核表達系統(tǒng)中全長表達，試用各種誘導(dǎo)條件均未成功。隨后改用密碼子優(yōu)化法，將p.f dynamin like protein1基因密碼子全部替換成大腸桿菌(E.coli)偏愛的密碼子，實現(xiàn)了p.f dynamin like protein1全長蛋白的表達，并證實其具有GTPase活性，且不受C末端131個氨基酸缺失的影響。 最后，通過使用dynamin特異性抑制劑dynasore，發(fā)現(xiàn)dynasore能夠有效地抑制p.f dy

5、namin like protein1的GTPase活性。將dynasore與培養(yǎng)的惡性瘧原蟲共孵育，能夠抑制惡性瘧原蟲的生長。結(jié)合前期研究結(jié)果與已經(jīng)明確dynamin家族的功能，提出了p.f dynamin like protein1參與瘧原蟲血紅蛋白內(nèi)吞的假設(shè)。通過生物化學(xué)方法顯示，dynasore的使用可以明顯地減少惡性瘧原蟲體內(nèi)血紅蛋白的累積以及瘧色素的形成，并能極大減少示蹤劑FITC標記的葡聚糖在惡性瘧原蟲中的累積，表明dyn

6、asore抑制了p.f dynamin like protein1的GTPase活性，進而影響了惡性瘧原蟲對血紅蛋白的內(nèi)吞作用：電鏡結(jié)果顯示，dynasore處理的惡性瘧原蟲體內(nèi)累積了大量的囊泡樣結(jié)構(gòu)，提示dynamin在內(nèi)吞通路中有重要作用。 本研究表明，p.f dynamin like proteinl參與了惡性瘧原蟲血紅蛋白內(nèi)吞過程，并發(fā)揮了重要作用。為揭示惡性瘧原蟲的內(nèi)吞機理提供了新的線索，也為將p.f dynamin