我國(guó)惡性瘧原蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)及其在溯源檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、瘧疾依然是威脅人類(lèi)健康的重要熱帶傳染病。據(jù)估計(jì)全球每年瘧疾患病人數(shù)為3-5億,死亡病例在100萬(wàn)以上。感染人類(lèi)的瘧原蟲(chóng)有四種,其中惡性瘧原蟲(chóng)致病最為嚴(yán)重,可引發(fā)重型瘧疾包括腦型瘧和妊娠相關(guān)瘧疾。目前,我國(guó)惡性瘧病例主要集中在云南和海南兩省,流行趨勢(shì)并無(wú)減弱之勢(shì)；加之我國(guó)西南邊境人口流動(dòng)頻繁及中非交流合作加強(qiáng),陸續(xù)有“輸入性瘧疾”病例報(bào)道。在國(guó)際上,對(duì)不同地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化開(kāi)展了廣泛的研究,這些研究已基本闡明全球其他地區(qū)惡

2、性瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株的遺傳變異特點(diǎn),對(duì)全球瘧疾防治工作發(fā)揮重要的理論指導(dǎo)作用。然而,迄今對(duì)我國(guó)瘧原蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究尚未系統(tǒng)展開(kāi),與國(guó)際上其它地區(qū)相比,目前尚缺乏我國(guó)不同地區(qū)瘧原蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)與基因多樣性遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)此,本課題通過(guò)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)不同染色體上的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,對(duì)我國(guó)不同地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)相關(guān)研究,旨在尋找和確定具有地區(qū)差異性的分子遺傳標(biāo)記,為建立我國(guó)惡性瘧原蟲(chóng)遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)和惡性瘧原蟲(chóng)溯源檢測(cè)技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。
　　

3、我們從云南和海南兩省不同流行地區(qū)采集惡性瘧疾患者血樣本。云南地區(qū)樣本采集地區(qū)按照地理分布主要分為三個(gè)區(qū)域:(1)怒江流域:流行區(qū)包括德宏自治州和中緬邊界區(qū)域,樣本來(lái)源為騰沖縣、龍陵縣、德宏自治州及與緬甸接壤地區(qū)包括境外的緬甸克欽邦拉咱地區(qū)。(2)瀾滄江流域:流行區(qū)包括臨滄地區(qū)、思茅地區(qū)及西雙版納傣族自治州,樣本來(lái)源為西雙版納傣族自治州的景洪市和勐臘縣。(3)紅河流域:流行區(qū)包括紅河自治州和文山自治州,樣本來(lái)源為紅河州紅河縣及元江縣。在云

4、南地區(qū)共采集瘧疾患者血樣本共341份。海南地區(qū)樣本采集地包括三亞市,樂(lè)東縣和東方市三個(gè)地區(qū),采集樣本數(shù)共計(jì)139份。所有樣本均采用試劑盒提取基因組DNA。參考目前國(guó)際廣泛應(yīng)用于地理株種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究的工具和方法,選擇惡性瘧基因組不同染色體上的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(MSs)對(duì)我國(guó)惡型瘧原蟲(chóng)進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析及遺傳多樣性研究。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)包括TA1、Polyα、PK2、TA81、TA109、TA42、TA40、TA60、ARA2、G37

5、7、2490和TA87,均為3個(gè)堿基重復(fù)類(lèi)型。每個(gè)MS位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條引物,其中1條為熒光標(biāo)記引物。采用半巢氏PCR方法擴(kuò)增每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),第二輪PCR采用熒光標(biāo)記引物,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行GENESCAN檢測(cè)。檢測(cè)得到不同的片段長(zhǎng)度,代表微衛(wèi)星等位基因的不同類(lèi)型。根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)上檢測(cè)到的等位基因的類(lèi)型和數(shù)目,對(duì)各地區(qū)感染樣本進(jìn)行多重感染的分析。依據(jù)所要檢測(cè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)變異特征,結(jié)合本課題實(shí)際情況,確定了區(qū)分單一感染和混合感染樣本的標(biāo)準(zhǔn),即:在1

6、2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,若單一等位基因的位點(diǎn)大于或等于9個(gè),則定義為單一感染樣本；若單一等位基因的位點(diǎn)少于9個(gè),則定義為多重感染樣本。按此標(biāo)準(zhǔn),六個(gè)地區(qū)的多重感染樣本的百分?jǐn)?shù)為:云南怒江流域24.1％,云南瀾滄江流域12.2%,云南紅河流域?yàn)?.7%,海南三亞為4.3%,海南樂(lè)東為10.3%以及東方市為10.9%。分析各地區(qū)樣本的種群結(jié)構(gòu)時(shí),需要排除多重感染樣本,將每個(gè)地區(qū)單一感染樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。首先分析和計(jì)算出各地區(qū)樣本在每個(gè)位點(diǎn)的等位基

7、因類(lèi)型和頻率,將各位點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入軟件計(jì)算等位基因數(shù)目和期望雜合度,計(jì)算遺傳距離,并分析進(jìn)化關(guān)系。
　　 本實(shí)驗(yàn)中六個(gè)采集地區(qū)的樣本在種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性方面顯示出差異。從12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,云南三個(gè)采集地結(jié)果分別為:怒江流域樣本平均的等位基因數(shù)目為7.833±0.878,平均期望雜合度為0.680±0.059；瀾滄江流域樣本平均等位基因數(shù)目為5.083±0.668,平均期望雜合度為0.672±0.057；紅河地區(qū)樣本平均

8、等位基因數(shù)目為3.000±0.461,平均期望雜合度為0.527±0.074；海南三個(gè)采集地樣本結(jié)果分別為:三亞地區(qū)樣本平均等位基因數(shù)目為4.000±0.492,平均期望雜合度為0.582±0.083；樂(lè)東縣樣本平均等位基因數(shù)為4.250±0.592,平均期望雜合度為0.588±0.067；東方市樣本平均等位基因數(shù)為5.250±0.676,平均期望雜合度為0.619±0.061。遺傳距離計(jì)算及種群進(jìn)化關(guān)系分析顯示,所有樣本分成兩大群體,

9、云南三個(gè)地區(qū)樣本為一個(gè)群體,海南三個(gè)地區(qū)樣本則為另一個(gè)群體。這與云南海南兩省的地理位置情況相一致。
　　 通過(guò)對(duì)所有樣本的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析,進(jìn)一步篩選出具有地區(qū)差異性分布的位點(diǎn),用于溯源檢測(cè)技術(shù)。首先根據(jù)先前進(jìn)化關(guān)系分析,將云南三個(gè)采集地區(qū)合并為一個(gè)大的群體,同理將海南三個(gè)地區(qū)樣本合并,將樣本分為云南和海南兩個(gè)群體進(jìn)行比較。依據(jù)云南與海南樣本在每個(gè)位點(diǎn)等位基因類(lèi)型和頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在Polyα、ARA2和TA87這三個(gè)位

10、點(diǎn)上,兩群體的等位基因類(lèi)型呈現(xiàn)明顯差異的數(shù)目多于其他位點(diǎn)。將海南樣本按照Polyα-ARA2-TA87位點(diǎn)依次逐步分類(lèi),得到海南樣本的候選微衛(wèi)星單體型為Polyα(184/187bp)-ARA2(69bp)-TA87(102bp)；同理將云南樣本依照Polyα-TA87-ARA2位點(diǎn)順序逐步分類(lèi),得到云南樣本的候選微衛(wèi)星單體型為Polyα(166/175/178bp)-TA87(72bp)-ARA2(96/105bp)。隨后在本實(shí)驗(yàn)單一

11、感染樣本中隨機(jī)抽取100例樣本,其中海南48例,云南52例。對(duì)照這些樣本在三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)類(lèi)型,用得出的地區(qū)特異性單體型判斷每個(gè)樣本可能的來(lái)源地,再與該樣本實(shí)際采集地作比較看是否結(jié)果一致。最后這100例樣本中總的一致率達(dá)92%,其中海南樣本的一致率為93.8%,云南樣本一致率為90.4%。通過(guò)此結(jié)果可以初步驗(yàn)證,本實(shí)驗(yàn)分析推斷兩個(gè)群體候選單體型的過(guò)程可行,得到的兩個(gè)候選單體型作為地區(qū)特異的瘧原蟲(chóng)遺傳標(biāo)識(shí),對(duì)溯源檢測(cè)技術(shù)具有應(yīng)用價(jià)值。但是仍