禽白細胞介素2功能域鑒定及與其受體的相互作用研究.pdf

1、浙江大學動物科學學院博士學位論文禽白細胞介素2功能域鑒定及與其受體的相互作用研究姓名：顧建友申請學位級別：博士專業(yè)：微生物學指導教師：周繼勇20090701浙江大學博士學位論文 摘要所識別的表位均為構象表位，其模擬表位分別為H H D P W D X L P 、E S L S R ) G ≮h C ( X L X P 、S H H L P T S X L 、H P D P W D A P L S S 和H E P W Q L X L 。

2、C l u s t a l W序列比對分析獲得了其相應的天然表位組成， 分別為1 1 4 K 1 5 D 1 6 P 3 4 w 4 2 Q 4 3 T ¨L 4 5 Q 4 6 、D 8 T 9 L 1 0 T 1 1 K 1 9 L 2 0 S 2 3 M 2 4 K 2 5 E 3 0 L 3 I y 3 2 p 3 4 、T l 1 E I S K l 9L 2 0 G 2 1 T 2 2 S 2 3 M 2 4 L

3、2 9 、T 3 3 P 3 4 E 3 6 S 4 1 w 4 2 D 6 1 P 8 8 P 8 9 L 1 1 5 R 1 1 6 S 1 1 7 和y 3 2 T 3 3 p 3 4 W 4 2 0 4 3 L 4 5Q 4 6 L 4 9 。對這些天然表位進行序列分析，可以發(fā)現一個共同的關鍵功能區(qū)域：T 11 1 1 4 K 1 5 D 1 6 E 1 8 K 1 9 L 2 0 G 2 1 T 2 2 S 2 3 M 2 4

4、 K 2 5 L 2 9 E 3 0 L 3 1 Y 3 2 T 3 3 P 3 4 E 3 6 S 4 1 W 4 2 Q 4 3 T 4 4 L 4 5 Q 4 6 ( 功能域I ) 。通過同源建模方法構建了g l L ．2 蛋白的三維模擬結構，將其功能域I定位于螺旋A 、A ．B 環(huán)和螺旋B 的N 端部分。比較雞、鴨、鵝I L 一2 的功能域組成及位置，發(fā)現在其分子的N 端區(qū)域均存在一個關鍵的功能域，而其中的第2 8 位到第4 6

5、 位序列均為最關鍵的功能位點，表明禽類I L ．2 分子的功能域分布具有相似性。利用體外抑制e I L ．2 依賴的T 淋巴母細胞增殖活性方法，分析了3 株識別真核細胞表達的雞I L ．2 R a 鏈( c C D 2 5 ) 的m A b s 的生物學活性，發(fā)現其中的2 株具有顯著的抑制功能。流式細胞計分析表明c C D 2 5 表達在脾單個核細胞的表面。利用噬菌體表面展示技術和合成肽競爭E L I S A 方法，鑒定了2 株抗e C

6、 D 2 5 功能性m A b s 的結合表位。該單抗的噬菌體模擬位基序為P V D R P R D 和S L G K X T P V D E P X Y 。利用C l u s t a lW 序列比對和合成肽競爭E L I S A 鑒定了其相應的天然表位組成，并據此將其天然表位劃分為一個功能域：K 1 5 2 w 1 5 3 T 1 5 4 P 1 5 5 v 1 5 6 D 1 5 7 R 1 5 8 P 1 5 9 C 1 6 0

7、T 1 6 1 ( 功能域I ) 。通過同源建模方法構建了c C D 2 5 蛋白胞外域的三維模擬結構，將其功能域I 定位于D 2 結構域的近C 末端部分。利用體外抑制c l L ．2 依賴的T 淋巴細胞增殖活性方法，分析了5 株識別真核細胞表達的雞I L ．2 R 丫鏈( c C D l 3 2 ) 的m A b s 的生物學活性，發(fā)現其中1 株m A b具有顯著的抑制功能。流式細胞計分析表明c C D l 3 2 表達在脾單個核細胞

8、的表面。利用噬菌體表面展示技術和合成肽競爭E L I S A 方法，鑒定了m A b C 1 0 的結合表位。該單抗的噬茵體模擬位基序為Q E H Q N L ，其相應的天然表位組成為Q 8 4 E 9 4 L 9 5 Q 9 6 N 9 7 L 9 8 。與人C D l 3 2 序列的比對分析顯示，Q 9 6 可能是個關鍵的功能位點，隨后發(fā)現定點突變Q 9 6 A 的表位多肽完全喪失了結合m A b C 1 0 的能力，證明了Q 9