我國間日瘧原蟲分離株Duffy抗原結(jié)合蛋白基因多態(tài)性分析.pdf

1、目的：探討我國瘧疾混合流行區(qū)間日瘧原蟲紅內(nèi)期候選抗原Duffy抗原結(jié)合蛋白(DBP)Ⅱ區(qū)基因多態(tài)性特點。 方法：從我國瘧疾高發(fā)混合流行區(qū)云南省采集瘧疾患者末梢血，制備血樣干濾紙片，QIAamp DNA mini kit(QIAGEN，德國)試劑盒提取間日瘧原蟲基因組DNA。根據(jù)間日瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株Sal—Ⅰ株DBPⅡ區(qū)為目的擴增片段設(shè)計特異性引物，以間日瘧原蟲基因組DNA為模板，采用高保真DNA聚合酶(KOD-Plus聚合酶，Toy

2、obo，日本)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增DBPⅡ區(qū)基因。對擴增所得片段純化后，用美國ABIPRIME測序儀進行基因測序。Sal—Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)株作為參照，利用BIOEDIT軟件對所獲得的基因序列進行排序(alignment)分析，檢測基因突變位點。以DnaSP4.50.3(http：//www．ub．es．dnasp/)和MEGA4.0軟件評估序列多態(tài)性。 結(jié)果：1、擴增了19個間日瘧原蟲DBPⅡ區(qū)(PvDBP RⅡ)基因序列600b

3、p長度片段(堿基位點853～1452bp)，編碼200個氨基酸(密碼子285～484)。2、我國間日瘧原蟲云南分離株與Sal—Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)株(Cent ral American株)比較，堿基水平共有13處發(fā)生突變，占2.17％(13/600)，導(dǎo)致12個氨基酸位點發(fā)生改變，占6.00％(12/200)，其中A1134→G位點為同義突變，未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變；核苷酸改變共產(chǎn)生9種基因型，相應(yīng)產(chǎn)生9種氨基酸型，以A1151G—G1169A-T

4、1270A基因型(相應(yīng)氨基酸型為D384G—R390H—L4241)為主(26.3％)。在堿基和氨基酸水平上未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。3、與國內(nèi)外瘧疾流行區(qū)PvDBP RⅡ氨基酸多態(tài)位點的觀察比較顯示，我國云南株P(guān)vDBP RⅡ氨基酸置換位點基本包含于國外報道的位點中，未發(fā)現(xiàn)地區(qū)特異性突變位點。4、核苷酸序列多態(tài)性分析結(jié)果顯示π=0.0091(SE：0.0028)；dn/ds=6.168(P<0.05)；Tajima's D=1.21360(P

5、>0.10)；Fu and Li's D*=1.48091(P<0.05)，F(xiàn)*=1.62640(P<0.05)。 討論：1.比較我國(云南、浙江和湖北)分離株的結(jié)果與南美、中東地區(qū)PvDBP RⅡ的基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，我國分離株P(guān)vDBP RⅡ基因突變位點相對有限，提示我國分離株紅內(nèi)期候選抗原DBP蛋白功能相對保守。2.本研究結(jié)果顯示，云南地區(qū)的PvDBP RⅡ的突變位點較浙江和湖北地區(qū)報道的位點，新發(fā)現(xiàn)3處突變位點，但發(fā)生頻率均

6、較低，這對分析我國不同流行區(qū)間PvDBP RⅡ基因多態(tài)性具有一定的提示意義。另外本研究還發(fā)現(xiàn)N417K和W437R位點呈關(guān)聯(lián)出現(xiàn)，提示針對該靶位開發(fā)的多價疫苗也可能對我國流行區(qū)有效。3.分析我國云南分離株P(guān)vDBP RⅡ的基因多態(tài)性的原因，可能整體上受到自然選擇的影響，呈正向選擇趨勢。我國云南分離株P(guān)vDBP RⅡ基因多態(tài)性突變位點的一些特點及影響多態(tài)性的可能因素分析，可為以PvDBP RⅡ為基礎(chǔ)建立有效傳播阻斷疫苗的研究提供一定的線索