丹參及同屬混淆品種子的系統(tǒng)鑒別研究.pdf

1、丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參的根及根莖，此外，在實際應用中還存在一些地方代用品與混淆品，如甘西鼠尾，蔭生鼠尾，雪見草及多種同屬植物。近年來，主產(chǎn)地栽培丹參逐步成為藥材的主要來源，但是，種子市場基源品種混亂，而且同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴重。幾種鼠尾草屬植物的種子在外部形態(tài)上非常相近，難以憑感官宏觀鑒別。為確保丹參藥材質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，在規(guī)?；?、規(guī)范化種植中首先要保證丹參種源純化、優(yōu)良。本實驗從外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)等方面，并利用細胞

2、生物學、分子生物學技術及超微技術對鼠尾草屬幾種植物的種子進行綜合鑒別研究。既有快速、簡便、實用、滿足基層需要的方法又有新技術與傳統(tǒng)中藥鑒定技術交叉融合的深層次鑒別研究，也是該省制定中藥種子標準前重要的應用基礎研究。 第一部分性狀、顯微、理化鑒別 目的：應用快速、簡便、實用的方法，建立丹參、甘西鼠尾、蔭生鼠尾、雪見草種子的外觀性狀、顯微特征、超微特征、理化性質(zhì)方面的綜合鑒別信息指征。 方法： 1.外觀性狀觀

3、察。 2.種皮脫色表面片制備：(1)脫色：取種皮切成12 mm小塊浸入水合氯醛(1：1)溶液中。(2)壓片觀察。 3.石蠟橫切片制備：(1)取材和固定：種子F．A．A固定液固定一周以上。(2)脫水：依次用濃度為70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、無水乙醇進行脫水，每隔2～3 h調(diào)換溶液。(3)透明：二甲苯：無水乙醇(1∶1)浸種1～2 h后，轉入二甲苯中至種子透明為止。(4)浸蠟：65℃恒溫箱中進行，半小時調(diào)蠟一

4、次，至種子完全浸透。(5)包埋和切片：石蠟包埋，切片厚度12μm。(6)貼片和融蠟。(7)染色：番紅－固綠雙重染色。(8)脫水與封藏。 4.種皮掃描電鏡觀察：(1)清洗：取種子用50％乙醇超聲清洗5min。(2)脫水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐級脫水，每一級脫水兩次，每次30 min，其間不斷震蕩清洗。(3)固定：戊二醛固定30 min。(4)電鏡觀察：真空噴金后，進行觀察。 5.紫外掃描

5、圖譜特征：(1)取過40目篩的種子粗粉各1.0 g用石油醚索氏提取3 h，制備供試液A；揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h，然后揮干乙酸乙酯用甲醇索氏提取3 h，制備供試液B。(2)掃描波長為200～400 nm的紫外吸收圖譜。(3)圖譜分析。 6.薄層色譜鑒別：(1)取一定量種子粉末用石油醚索氏提取3 h制備供試液C，揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h，制備供試液D，供點樣；(2)點樣，展開。(3)顯色、觀察、照相。

6、 7.高效液相鑒別：提?。杭状妓魇咸崛悠分械某煞郑簧V條件：選用合適的色譜柱，調(diào)整流動相的組成、配比、pH、檢測波長及流速，使樣品中所含成分色譜峰的分離度符合測定要求。 結論：丹參、甘西鼠尾、蔭生鼠尾和雪見草的種子在外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)存在差異，可用于鑒別。方法快速、簡便、實用。 第二部分細胞生物學及分子生物學特征研究 目的：利用染色體組型分析及種子蛋白質(zhì)PAGE和SDS-PAGE技術研究藥用丹參品種

7、之間及鼠尾草屬幾種植物種子的綜合鑒別信息指征，從細胞水平及分子水平鑒別真?zhèn)危榈⒌钠贩N篩選提供依據(jù)。 方法： 1.根尖體細胞染色體標本片制備：(1)預處理：種子25℃下萌發(fā)，根尖長0.5～1.0 cm時切取，蒸餾水4℃處理24 h。(2)固定：卡諾固定液(無水乙醇：冰醋酸3∶1)固定10～1.5 h。(3)解離：95％乙醇：濃鹽酸(1∶1)解離10～115min。(4)后低滲：重蒸水低滲，時間8～15 min。(5)

8、染色：改良石炭酸品紅液染色。(6)封片：冰凍揭蓋片，中性樹膠封片。(7)顯微照相、計數(shù)、測量。 2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征研究：(1)制備供試品溶液。(2)制備分離膠和濃縮膠。(3)電泳：恒定電壓120～180 V。(4)染色和洗脫：考馬斯亮藍(R-250)染色，脫色液洗脫至背景清晰為止。(5)結果分析：繪圖并測定特征譜帶泳動率。 3.SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜特征研究：(1)