云南省主要推廣核桃品種的分子標(biāo)記鑒別及遺傳分析.pdf

1、漾濞核桃(JuglanssigillataDode)為云南省重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一，隨著云南省核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)于核桃遺傳背景方面知識(shí)的需求和應(yīng)用科學(xué)手段鑒別核桃品種，維持核桃市場(chǎng)秩序的需求日益增加。本研究利用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)分子標(biāo)記和ISSR(Inter-simpleSequenceRepeats簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū))分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)云南省11個(gè)漾濞核桃品種進(jìn)行分

2、子鑒別和遺傳分析。為品種鑒別提供分子水平上的參考，為核桃的育種提供理論依據(jù)。參試的11個(gè)核桃品種包括4個(gè)云南鄉(xiāng)土核桃品種：漾濞泡核桃、大姚三臺(tái)核桃、夾綿核桃和鐵核桃和7個(gè)優(yōu)良雜交品種：云新高原核桃(云新7914號(hào))、云新云林核桃(包括：云新7926號(hào)、云新8034號(hào)、云新8064號(hào))、云新90301號(hào)、云新90303號(hào)和云新90306號(hào)。研究的內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.DNA提?。阂匝ㄅ莺颂也煌L(zhǎng)時(shí)期的葉片為材料，采取了高鹽低P

3、H法和CTAB沉淀法提取基因組DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)和RAPD擴(kuò)增3種方法對(duì)所提取的DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。比較所得DNA的產(chǎn)量、質(zhì)量，認(rèn)為不同發(fā)育時(shí)期葉片得DNA提取效果不同，其中以冬芽和新葉效果較好，老葉最差；兩種提取方法得到得的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量有所不同，高鹽低PH法提取的DNA純度高，但是產(chǎn)量較低，而CTAB法則相反，產(chǎn)量高，純度低。 2.建立穩(wěn)定的反應(yīng)體系以漾濞核桃中的大姚三臺(tái)核桃為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)影響

4、RAPD擴(kuò)增結(jié)果的主要因子：Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的濃度組合和擴(kuò)增程序的試驗(yàn)研究，確定了漾濞核桃的最適RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。即在25uL反應(yīng)體系中包括0.75u.L-1TaqDNA聚合酶，3.0mmol.L-Mg+2，0.3mmol.L-1引物，含1.6mg.L-1模板，2.5ul10×Buffer，dNTPs各0.2mmol.L-1。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性300s，94℃變性40s，36℃退火6

5、0s，72℃鏈延伸120s，45次循環(huán)后，72℃延伸600s。 ISSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?yàn)榭偟?0uL反應(yīng)體系中包含：模板DNA1.OuL(50ng)，10×Buffer2.OuL，10pmol.uL-1引物1.5uL，2.5mMdNTPs1.6uL，25mMMg+21.8uL，5UTaqDNA聚合酶0.12uL，ddH2011.98uL；熱循環(huán)體系為：95℃預(yù)變性600s，然后94℃變性30s，50℃退火60s，72℃鏈延伸

6、120s，共35個(gè)循環(huán)最后72℃延伸420s。 3.引物篩選通過(guò)對(duì)RAPD和ISSR引物的篩選，分別篩選出8個(gè)能夠擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定并能擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)的RAPD引物和ISSR引物。RAPD引物為：SBSA07、SBSA08、SBSB06、SBSE11、SBSF10、SBSS03、SBSS06和SBSS10；ISSR引物及其退火溫度為：ISSR01、ISSR04、ISSR14(退火溫度50℃)，ISSR08、ISSR09、ISSR

7、12、ISSR25(退火溫度52.8℃)和ISSR23(退火溫度48.6℃)。 4.指紋圖譜建立，品種分子鑒別：RAPD引物SBSS06號(hào)引物所擴(kuò)增的位點(diǎn)能夠完全鑒別出11個(gè)漾濞核桃品種；ISSR標(biāo)記的ISSR08和ISSR09這兩條引物結(jié)合能夠鑒別出參試的11個(gè)漾濞核桃品種，由此建立了各品種的指紋圖譜。 5.遺傳多樣性：RAPD檢測(cè)得到多態(tài)位點(diǎn)(PPB)值為61.63％，平均每條引物獲得6.625個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)；ISSR

8、檢測(cè)，PPB為63.27％，平均每個(gè)引物7.75個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，說(shuō)明11個(gè)核桃品種間有一定的遺傳差異。POPGENE32軟件分析獲得的遺傳多樣性參數(shù)分另為，RAPD檢測(cè)的等位基因數(shù)(Ne)為1.3552，基因的多樣性(H)為0.2110，Shannon信息指數(shù)(I)為0.3188；ISSR檢測(cè)的Ne為1.3707，H為0.2143和I為0.3216，以上數(shù)據(jù)表明這11個(gè)品種間的遺傳多樣性水平不高。 6.品種間近緣關(guān)系：用RAPD和

9、ISSR檢測(cè)所得的Nei's遺傳距離對(duì)參試的11個(gè)品種進(jìn)行聚類(lèi)分析分別繪制聚類(lèi)圖。RAPD檢測(cè)的結(jié)果可以將11個(gè)品種分為三組：鄉(xiāng)土優(yōu)良品種(漾泡和三臺(tái)核桃)，雜交優(yōu)良品種(14、26、34、64、301、303和306)和品質(zhì)較差的鄉(xiāng)土品種(夾綿核桃和鐵核桃)。ISSR檢測(cè)的結(jié)果將11個(gè)品種分為4組：兩個(gè)云南優(yōu)良鄉(xiāng)土品種、兩個(gè)品質(zhì)較差的鄉(xiāng)土品種、親本組合為漾濞泡核桃×云林A7號(hào)的4種(云新云林14、26、34、64)和親本組合為三臺(tái)核桃