云南省埃及伊蚊種群遺傳特征研究.pdf

1、登革熱是由登革病毒引起的一種重要蟲媒傳染病，近年來，全球登革熱發(fā)病率急劇上升，有100多個國家呈地方性流行，其中東南亞是受侵襲最嚴(yán)重的地區(qū)之一。云南省在歷史記載中有過少量登革熱輸入病例的報道，但自從2008年開始出現(xiàn)本地感染病例以后，尤其是2013年以來云南省已經(jīng)多次發(fā)生由輸入病例引起的本地感染登革熱疫情暴發(fā)。
　　埃及伊蚊是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，是登革熱的主要傳播媒介。埃及伊蚊起源于非洲，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。雖然其飛行擴(kuò)散距離

2、有限，但可以通過成蚊、蛹、幼蟲、卵等方式隨著飛機(jī)、輪船、汽車運輸或其他人類活動而發(fā)生遠(yuǎn)距離的被動擴(kuò)散，在19世紀(jì)后期通過航運入侵到東南亞。2000年以前，埃及伊蚊在我國的分布也僅限于北緯22°以南地區(qū)，包括臺灣南部、海南以及廣東、廣西的部分地區(qū)和個別島嶼，在云南省并未有過埃及伊蚊的記載。然而，全球化發(fā)展以及全球氣候變暖，為媒介生物的擴(kuò)散提供了更加便利的條件。自2002年2月首次在云南省發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊以來，現(xiàn)已在瑞麗、芒市、勐臘、勐海、景洪

3、、盈江、隴川、瀘水、耿馬等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，且分布范圍和種群數(shù)量不斷擴(kuò)大，入侵和擴(kuò)散形勢非常嚴(yán)峻，埃及伊蚊已經(jīng)成為了云南省的一個重要外來入侵蚊種。而且，與云南省接壤的越南、緬甸和老撾等國家均有埃及伊蚊且登革熱頻發(fā)，埃及伊蚊的入侵則加重了云南省登革熱暴發(fā)和流行的風(fēng)險。但是，目前對我國云南省的埃及伊蚊研究大多僅限于分布調(diào)查層面上，對于其種群遺傳分化及特征、抗藥性水平及機(jī)制等方面缺乏深入研究。
　　基于以上原因，本研究以云南省埃及伊蚊為研究對

4、象，通過現(xiàn)場采集云南省不同地區(qū)的埃及伊蚊自然種群，主要從兩個方面予以深入研究。一是提取基因組DNA，綜合利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記和線粒體DNA基因COI、ND4、ND5進(jìn)行種群遺傳特征研究，以期了解和掌握云南省埃及伊蚊種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特征，并對其種群結(jié)構(gòu)和入侵事件予以探討；二是將現(xiàn)場采集的埃及伊蚊進(jìn)行實驗室傳代養(yǎng)殖后，通過蚊蟲抗藥性生物學(xué)測定、代謝酶活性以及靶標(biāo)基因的檢測，掌握云南省埃及伊蚊對常用殺蟲劑的抗藥性水平和抗藥性分子特征，

5、為化學(xué)殺蟲劑防治埃及伊蚊提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究結(jié)果如下：
　　1、微衛(wèi)星研究結(jié)果
　　本研究通過文獻(xiàn)查找，篩選獲得的9個微衛(wèi)星位點容易擴(kuò)增且穩(wěn)定性好、差異性明顯、多態(tài)信息含量高（PIC=0.392~0.886）。結(jié)果表明所選用的9個微衛(wèi)星位點能夠充分滿足本研究的需要，每個種群的樣本采集量能夠滿足研究的樣本含量需求。9個微衛(wèi)星位點從28個埃及伊蚊自然種群中共獲得等位基因數(shù)114個，平均每個位點獲得等位基因數(shù)12.67

6、個。從位點角度分析看，每個位點平均在每個種群獲得的等位基因在3.46~7.14之間。各種群的基因豐富度在3.34~5.72之間，瑞麗和景洪兩地埃及伊蚊的種群基因豐富度較為接近，且均高于2016年在其他邊境地區(qū)采集的埃及伊蚊種群。
　　云南省埃及伊蚊種群總體上具有較高的遺傳多樣性，9個微衛(wèi)星位點的觀察雜合度在0.108~0.939之間，平均觀察雜合度為0.579；而期望雜合度在0.367~0.760之間，平均期望雜合度為0.592。

7、各種群的觀察雜合度在0.401~0.689之間，其中2016年在其他邊境地區(qū)采集的8個種群觀察雜合度高于期望雜合度，瑞麗和景洪地區(qū)采集的20個種群均為觀察雜合度低于期望雜合度。
　　基因型連鎖不平衡分析顯示云南28個埃及伊蚊自然種群的9個位點之間的1008對位點中，有166對位點存在著顯著的連鎖情況（P<0.05），其他位點均表現(xiàn)為獨立遺傳（P>0.05）。
　　哈迪溫伯格平衡檢驗顯示28個種群中僅有景洪（GLR）、勐海（M

8、1H）2個種群發(fā)生了哈溫平衡偏離。采用TPM和SMM兩種模式檢測云南埃及伊蚊種群近期是否經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)，結(jié)果顯示共有10個自然種群產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng)，其中瑞麗地區(qū)采集的10個種群中有6個（MNL、JDL、JGH、JCG、GMG、CXT）種群產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng)，占瑞麗地區(qū)種群的60％；2016年在其他邊境地區(qū)采集的8個自然種群中有4個產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng)，占50%；而景洪地區(qū)采集的10個種群均沒有產(chǎn)生瓶頸效應(yīng)。
　　近交系數(shù)結(jié)果顯示2016年在

9、其他邊境地區(qū)采集的8個種群中有7個種群的近交系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表示這7個種群近交程度很低，而其他種群的近交系數(shù)為正值，意味著這些種群存在不同程度的近交。
　　成對固定指數(shù)（FST）分析顯示，各種群間僅有17個成對固定指數(shù)（FST）未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化，其余361個成對固定指數(shù)（FST）均表現(xiàn)出明顯的遺傳分化。
　　應(yīng)用STRUCTRUE軟件對各個個體的聚類分析，結(jié)合群體內(nèi)遺傳差異數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示當(dāng)K=3時，將云南省不同地區(qū)的28

10、個埃及伊蚊種群分為3類較為合理，瑞麗地區(qū)采集的10個種群、景洪地區(qū)采集的10個種群以及2016年在其他邊境地區(qū)采集8個種群各聚成1類。基于Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離應(yīng)用UPGMA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與PCoA圖譜分析也顯示同樣的結(jié)果。
　　分子方差分析（AMOVA）表明不同組之間存在明顯的分化，占14.51%；同一區(qū)域內(nèi)不同種群之間的遺傳分化占總的6.01%；來自個體之間的遺傳分化最為顯著，占77.76%。相關(guān)性分析顯示地理距離和遺傳分化之

11、間呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.4948，P<0.0001）。
　　綜合分析判斷，2002年發(fā)現(xiàn)的瑞麗入侵和2013年發(fā)現(xiàn)的景洪入侵應(yīng)為不同的入侵事件，而2016年采集的其他邊境地區(qū)仍然存在著持續(xù)的多點入侵。
　　2、線粒體DNA研究結(jié)果
　　本研究分析了云南省瑞麗和景洪地區(qū)20個不同的埃及伊蚊地理種群的線粒體基因CO I、ND4和ND5的基因多樣性指數(shù)，結(jié)果顯示CO I基因A+T的含量為66.9%，共獲得381個多態(tài)性位點，多

12、態(tài)性位點占堿基總數(shù)的45.36%（其中包括66個自裔位點和315個簡約信息位點），共獲得單倍型14種，總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.02265、單倍型多樣性指數(shù)為0.5583。ND4基因A+T的含量為70.0%，共獲得334個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點占堿基總數(shù)的55.76%（其中包括126個自裔位點和191個簡約信息位點），共獲得單倍型18個，總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.01860、基因單倍型多樣性指數(shù)為0.47156。ND5基因A+T的含

13、量為74.6%，共獲得369個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點占堿基總數(shù)的60.89%（其中包括109個自裔位點和254個簡約信息位點），共獲得單倍型5種，總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.07223、單倍型多樣性指數(shù)為0.5098。由于ND5基因片段的單倍型較少（僅5種），本研究僅利用COI和ND4對瑞麗和景洪地區(qū)的20個埃及伊蚊地理種群進(jìn)行了遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)研究。
　　基于COI基因的遺傳分化結(jié)果顯示景洪的GGH種群與瑞麗的MNL、BFC、

14、HDH、BNS等4個種群遺傳分化不顯著，反而與景洪地區(qū)的GXS、JBQ、YSC、DMY、GSZ、NKH等5個種群間具有明顯的遺傳分化。而基于ND4基因的遺傳分化結(jié)果顯示瑞麗的HDH種群與景洪的LJY、JBQ、YSC三個種群間不存在明顯的遺傳分化，更有意思的是，該種群與瑞麗地區(qū)其他9個種群具有明顯的遺傳分化。說明瑞麗和景洪地區(qū)的埃及伊蚊種群間可能存在著相互交流?；贑O I和ND4基因的遺傳分化結(jié)果均顯示，景洪地區(qū)各種群間遺傳分化水平明顯

15、低于瑞麗地區(qū)各種群間的遺傳分化。這一結(jié)果與微衛(wèi)星研究的結(jié)果相似。
　　線粒體COI和ND4基因單倍型雖然能夠被網(wǎng)絡(luò)圖分布格局與NJ進(jìn)化樹分化為2個分支，但結(jié)合各單倍型的地理種群分布，無法進(jìn)行非常清楚地分支。Tajima’SD和 Fu’sFS中性檢驗出現(xiàn)了顯著的負(fù)值，核苷酸錯配分布顯示分布曲線均呈單峰結(jié)構(gòu)形式，這些結(jié)果都說明這些地區(qū)的埃及伊蚊經(jīng)歷了明顯的種群擴(kuò)張。
　　3、抗藥性生物學(xué)測定結(jié)果
　　以實驗室養(yǎng)殖的云南埃及

16、伊蚊敏感株為參照，采用敏感基線法對幼蟲進(jìn)行生物學(xué)測定，三種殺蟲劑的毒力以殘殺威最低（LC50=1.02882mg/L，95%CI：0.97708~1.08173 mg/L）， 其次為敵敵畏（LC50=0.0367 mg/L，95%CI：0.03580~0.03770 mg/L），高效氯氰菊酯毒力最高（LC50=0.00102 mg/L，95%CI：0.00088~0.00118 mg/L）。對2016年在云南省西雙版納傣族自治

17、州和德宏州采集的12個埃及伊蚊自然種群幼蟲的生物學(xué)測定結(jié)果顯示，對高效氯氰菊酯的抗性倍數(shù)在11.31~41.56之間，而對敵敵畏和殘殺威雖然抗性水平略有升高，尚未達(dá)到抗性種群的標(biāo)準(zhǔn)。通過敏感基線法獲得云南埃及伊蚊敏感株的對三種殺蟲劑的成蚊診斷劑量分別為殘殺威983.41 mg/L、敵敵畏181.95 mg/L、高效氯氰菊酯1493.37mg/L。以診斷劑量法對各自然種群埃及伊蚊成蚊進(jìn)行生物學(xué)測定，成蚊生物學(xué)測定結(jié)果也顯示只對高效氯氰菊酯

18、產(chǎn)生了抗藥性，成蚊生測結(jié)果與幼蟲生測結(jié)果基本一致。
　　4、代謝解毒酶活性檢測結(jié)果
　　本研究采用WHO推薦的生物化學(xué)測定法檢測了云南埃及伊蚊各自然種群的代謝解毒酶活性，結(jié)果顯示：各野外種群在受到殘殺威抑制作用后，ACHE活性為未受抑制作用的22.36-31.60%之間，其中僅有J-3和J-5略高于30%；以α-Naphthyl Acetate為底物檢測得到敏感株EST（1-N）活性均值為111.1717±34.9588 n

19、mole of1-naphthol/min/mg protein，而野外種群的EST（1-N）活性均值在41.7940 nmole of1-naphthol/min/mg protein~198.5297 nmole of1-naphthol/min/mg protein之間；以β-Naphthyl Acetate為底物檢測得到敏感株EST（2-N）活性為135.4011±47.3301 nmole of2-naphthol/min/m

20、g protein，野外種群的EST（2-N）活性在39.7117 nmole of2-naphthol/min/mg protein~214.0106 nmole of2-naphthol/min/mg protein之間；敏感株MFO活性為3.08±3.77nmol cytochrome C/mg protein，野外種群的MFO活性在5.43 nmol cytochrome C/mg protein~20.11 nmol cyto

21、chrome C/mg protein之間，與敏感株相比，野外種群的MFO活性均高于敏感種群；敏感株GST活性為1.2504±0.3961 nmol of CDNB/min/mg protein，野外種群的GST活性在0.6178 nmol of CDNB/min/mg protein~3.4939 nmol of CDNB/min/mg protein之間。上述結(jié)果中僅有MFO在所有野外種群中的酶活性升高，而其他代謝酶在不同種群中的表