高糖對腎組織干細胞的影響及其損傷機制初探.pdf

1、目的:
　　從大鼠腎乳頭處分離培養(yǎng)腎組織干細胞(KSC),鑒定其生物學特征及干細胞特性。評估高糖對KSC基本特征、旁分泌作用及向腎小管上皮細胞(RTEC)分化能力的影響。
　　方法:
　?、購?周齡雄性SD大鼠雙腎腎乳頭部位分離培養(yǎng)KSC,觀察細胞形態(tài)特征,通過細胞流式、免疫熒光鑒定KSC的表型特征,通過成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定其分化能力,并通過qRT-PCR比較KSC與RTEC基因表達的差異。
　?、诒容^KSC在

2、高糖(30mmol/L)和正糖(5.6mmol/L)培養(yǎng)基的微環(huán)境下細胞形態(tài)、增殖能力、相關(guān)表型標記物、趨化因子表達及耐缺氧能力的差異。
　?、鄯謩e用正糖和高糖培養(yǎng)基對KCS進行預(yù)處理后制備KSC上清,建立大鼠RTEC缺氧/復(fù)氧(H/R)模型,比較高糖與正糖KSC上清對H/R RTEC修復(fù)作用的差異。
　　④對KSC進行誘導(dǎo)分化,比較兩種誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)效率的差異;將 KSC分別用高糖和正糖培養(yǎng)基預(yù)處理4d,然后按照共培養(yǎng)方案進

3、行誘導(dǎo),比較兩種KSC經(jīng)誘導(dǎo)后成熟上皮細胞標記物E-Cad、CK-18、AQP-1表達的差異。
　　結(jié)果:
　?、貹SC主要呈紡錘形或樹枝狀生長,免疫熒光結(jié)果顯示可表達α-SMA、Vimentin、N-Cadherin、Nestin、CD133,不表達E-Cadherin、CK-18、ZO-1,細胞流式結(jié)果CD29、CD90、CD73、CD45表達比率分別為99％、95.8%、99.9%和3.4%,干細胞標記CD133和Ne

4、stin,陽性率分別為33.2%和70.2%,雙陽性率為31.4%,成脂誘導(dǎo)后油紅O染色呈紅色,成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色呈橙紅色,Von kossa染色成黑色,qRT-PCR結(jié)果顯示:與RTEC相比,原始胚胎干細胞標記物Nanog、Oct4/pou5f1、Sox2/sry-box-2和間質(zhì)標記物a-SMA、Vimentin的mRNA表達量在KSC中顯著增高(P<0.01),而成熟的上皮細胞標記物E-Cadherin、CK18的mRNA表達量

5、在KSC中顯著降低(P<0.01)。
　?、诩毎鲋硻z測結(jié)果提示從第4天開始高糖組細胞生長較正糖組緩慢,免疫熒光結(jié)果提示 KCS經(jīng)高糖處理后,纖維連接蛋白(Fibronectin)、I型膠原(Collagean I)、IV型膠原(Collagean IV)的合成增加;qRT-PCR檢測結(jié)果顯示KSC經(jīng)高糖干預(yù)后,Fibronectin、Collagean I、Collagean IV mRNA表達增高,間質(zhì)標記物a-SMA、Vim

6、entin基因表達進一步升高,促纖維化因子TGF-b、CTGF、PAI-1 mRNA表達均升高;經(jīng)高糖預(yù)處理96h后,KSC耐缺氧能力下降,低氧培養(yǎng)24h細胞分裂增殖指數(shù)低于正糖KSC,基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體 CXCR4的基因表達均顯著降低(P<0.01)。
　?、廴毖?h/復(fù)氧2h為RTEC H/R模型最佳時間,缺氧后,RTEC凋亡率升高,上清的LDH和MDA水平升高(P<0.01),SOD水平降低(P<0.

7、01)。進行KSC上清干預(yù)12h和24h后,與對照組相比,正糖組和高糖組RTEC的凋亡率均明顯降低,LDH和MDA水平均顯著降低(P<0.01),SOD水平均顯著升高(P<0.01)。正糖組和高糖組兩組間比較,高糖組RTEC的凋亡率略高于正糖組,LDH和MDA水平要高于正糖組(P<0.05),SOD水平要顯著低于高糖組(P<0.01)。
　　④細胞因子誘導(dǎo)的同時與缺氧損傷的 RTEC共培養(yǎng)誘導(dǎo)后, CK-18陽性率最高,為44.2

8、%,成熟上皮細胞標記CK-18、E-Cadherin、ZO-1部分陽性表達。正糖KSC和高糖KSC經(jīng)共培養(yǎng)方案進行誘導(dǎo)后,細胞流式結(jié)果提示,高糖 KSC誘導(dǎo)組 CK-18陽性率顯著低于正糖組(P=0.045);qRT-PCR結(jié)果提示,高糖KSC誘導(dǎo)組成熟上皮細胞標志 E-cadherin、AQP-1基因表達水平顯著低于正糖組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　?、倌I乳頭部位可以分離培養(yǎng)出具有間充質(zhì)干細胞特性的KSC。