高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號 10101034 </p><p>　　1分類號 Q2 </p><p>　　密 級 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論

2、文)</b></p><p>　　高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響</p><p><b>　　2014年 6月 </b></p><p><b>　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書</p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目

3、：</p><p>　　高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　動脈粥樣硬化是動脈血管的一種慢性炎癥反應(yīng)，在粥樣硬化區(qū)域能夠檢測到巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)的聚集。高糖可促進(jìn)血液單核細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移，而對

4、淋巴細(xì)胞的影響研究相對較少，此前的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)檢測到高糖促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，本實(shí)驗(yàn)主要檢測高糖是否促進(jìn)淋巴細(xì)胞的遷移。 </p><p>　?、蟆厴I(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　　1. 熟練掌握淋巴細(xì)胞（Jurkat cell line）的復(fù)蘇、傳代

5、和凍存，配制常用細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑； </p><p>　　2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞死亡及增值的檢測； </p><p>　　3. 細(xì)胞遷移的檢測 </p>&

6、lt;p>　　4. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和處理 </p><p><b>　　Ⅳ、主要參考資料：</b></p><p>　　[1] Zernecke A and Weber C. Chemokines in the vascular inflammatory response of at

7、herosclerosis[J]. Cardiovascular Research, 2010, 86: 192–201. </p><p

8、>　　[2] Di ME,Gray SP, Jandeleit-Dahm K. Diabetes alters activation and repression of pro- and anti-inflammatory signaling pathways in the vasculature. Front Endocrinol. 2013, 4:68.

9、 </p><p>　　[3] Grivel JC, Ivanova O, Pinegina N, et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011,31: 2929-2937. <

10、/p><p>　　[4] Tse K, Tse H, Sidney J,et al. T cells in atherosclerosis[J]. International Immunology ,2013,25; 615–622 . </p><p>　　生物與醫(yī)學(xué)工程 學(xué)院 生物與醫(yī)學(xué)工程 專業(yè)類 101012

11、班</p><p>　　學(xué)生 次央 </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 2014年 3月 10 日至 2014 年 6 月 10 日</p><p>　　答辯時(shí)間： 2014 年 6 月 10 日</p><p>　　成 績： </p><p>　　指導(dǎo)教師：

12、 次央 </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p>　　系（教研室）主任（簽字）： </p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出

13、。</p><p><b>　　作者：次央</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間：2014年 6 月</p><p>　　高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響</p><p>　　學(xué) 生：次央 </p><p><

14、;b>　　指導(dǎo)教師：桑晨</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　糖尿病患者中動脈粥樣硬化的患病率和發(fā)病率遠(yuǎn)高于正常人。在動脈粥樣硬化形成過程中，白細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞并遷移至血管壁是早期的重要事件我們此前的實(shí)驗(yàn)表明高糖環(huán)境能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，但高糖環(huán)境是否能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移的研究并不多。因此，本實(shí)

15、驗(yàn)以Jurkat淋巴細(xì)胞為研究對象，利用transwell小室，研究高糖是否影響淋巴細(xì)胞的遷移。 </p><p>　　Jurkat細(xì)胞分別在葡萄糖濃度為5.5和22.2mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后將細(xì)胞加入到transwell中遷移12小時(shí)，隨后計(jì)數(shù)遷移至下室的淋巴細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同的糖濃度（5.5Mm和22.2Mm）培養(yǎng)24h對細(xì)胞的增值沒有明顯影響，高糖組遷移的Jurkat細(xì)胞顯著少于低糖組細(xì)胞

16、，其影響機(jī)制需要進(jìn)一步的研究加以明確。</p><p>　　關(guān)鍵詞：高糖，Jurkat細(xì)胞， 遷移</p><p>　　High Glucose affected Lymphocytes Migration</p><p>　　Author: Ci Yang</p><p>　　Tutor: SANG Chen</p><

17、p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The atherosclerosis prevalence and incidence in diabetes are much higher than normal. During the process of atherosclerosis formation, it is an early and important

18、 event that leukocytes adhere to endothelial cells and migrate to the vessel wall. The increased leukocyte and endothelial cell adhesion is likely to promote the atherosclerosis. We observed previously that high glucose

19、can facilitate lymphocytes adhesion to endothelial cells, but it is not clear whether high glucose promote lymphocyte</p><p>　　Jurkat cells were cultured in the mediums in which the glucose concentrations ar

20、e 5.5 and 22.2mM for 24hours, then we seed the cells in the transwell for 12 hours migration test, then counting the cells migrated to plate well, we found that the cells cultured in 5.5Mm glucose are more prone to migra

21、te than those in high glucose, the mechanism is not clear, so further study is needed in future.</p><p>　　Key words：High glucose, Jurkat cell, Cell migration</p><p><b>　　目 錄</b>

22、;</p><p><b>　　1緒論1</b></p><p>　　1.1 課題背景及目的1</p><p>　　1.1.1 糖尿病和動脈粥樣硬化1</p><p>　　1.1.2 動脈粥樣硬化形機(jī)制成2</p><p>　　1.1.3 白細(xì)胞遷移2</p><p

23、>　　1.1.4 粘附分子和趨化因子3</p><p>　　1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀5</p><p>　　1.2.1 血糖促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生的可能機(jī)制5</p><p>　　1.2.2 糖尿病和炎癥7</p><p>　　1.2.3 高糖對趨化和粘附因子的影響8</p><p>　　1.2.4 高糖對

24、內(nèi)皮細(xì)胞影響8</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究內(nèi)容11</p><p>　　1.3.1 研究內(nèi)容11</p><p>　　1.3.2 論文構(gòu)成11</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)方法12</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料12</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)

25、胞12</p><p>　　2.1.2 主要試劑12</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)常用耗器材12</p><p>　　2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器12</p><p>　　2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用各種溶液的配置13</p><p><b>　　2.2 方法14</b></p>

26、<p>　　2.2.1 Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)14</p><p>　　2.2.2 遷移實(shí)驗(yàn)15</p><p>　　2.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析16</p><p>　　2.2.4 注意事項(xiàng)16</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論17</p><p>　　3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17</

27、p><p>　　3.1.1 不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞增殖的影響17</p><p>　　3.1.2不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞遷移的影響17</p><p>　　3.1.3高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)液對Jurkat細(xì)胞遷移的影響18</p><p>　　3.1.4高濃度葡萄糖培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞遷移特性的改變20</p>

28、;<p><b>　　3.2 討論21</b></p><p><b>　　結(jié)論24</b></p><p><b>　　致謝25</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)26</b></p><p><b>　　緒論&

29、lt;/b></p><p>　　1.1 課題背景及目的</p><p>　　在如今，隨著經(jīng)濟(jì)高速的發(fā)展和工業(yè)化進(jìn)程的加速，威脅人類健康的非傳染性疾病日益增重，其中糖尿病和隨之而來的合并癥因此受到了廣泛關(guān)注，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（The International Diabetes Federation，IDF）的統(tǒng)計(jì)，2000年全球糖尿病患者為1.51億人，目前這個數(shù)字已上升到2.8

30、5億，預(yù)計(jì)到2030年，全球糖尿病患者的數(shù)量將達(dá)到5億[1]。</p><p>　　近30年來，我國糖尿病患病率有明顯的上漲趨勢，從1993年開始，糖尿病的發(fā)病人數(shù)在逐年增加，最新調(diào)查結(jié)果顯示我國2009年的糖尿病患者比2008年上漲6.5倍[2]。國內(nèi)近年來的各項(xiàng)大型調(diào)查也顯示，中國糖尿病患病率呈逐年持續(xù)快速增長趨勢，有一項(xiàng)調(diào)查顯示，我國糖尿病標(biāo)化患病率已達(dá)9.7%，相當(dāng)于每 10 個成年人中就有一個糖尿病患者

31、，而糖尿病前期的比例高達(dá)15.5%，相當(dāng)于每 6～7 個成年人中就有一個高血糖狀態(tài)者[3]。</p><p>　　糖尿病可分為兩類：1型糖尿病，也被稱為胰島素依賴型糖尿（insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM），通常是因?yàn)橄忍煨缘淖陨砻庖邠p傷胰島致使胰島素分泌不足形成的；2型糖尿病，被稱為非胰島素依賴型糖尿?。╪oninsulin-dependent diabetes

32、mellitus, NIDDM），是多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，伴隨著因胰島素分泌減少或功能障礙引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的異常。</p><p>　　1.1.1 糖尿病和動脈粥樣硬化</p><p>　　研究表明糖尿病可引發(fā)包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的多種并發(fā)癥，糖尿病患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)高于普通人的，糖尿病相關(guān)的死亡大概有80%是因?yàn)樾难芗膊∫鸬腫4]。在這么多的并發(fā)癥

33、之中，2型糖尿病易于導(dǎo)致動脈粥樣硬化的因素是多方面的，包括多種代謝綜合征，例如高脂血癥、高血糖癥、高血壓和肥胖（尤其是腹部肥胖）。肥胖同時(shí)也會引起高脂血癥和高膽固醇血癥的發(fā)生，在經(jīng)典動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中高脂血癥和高膽固醇血癥與之存在著密切的關(guān)系[5]。但是目前糖尿病所導(dǎo)致動脈粥樣硬化的原因并沒有完全的明確。</p><p>　　1.1.2 動脈粥樣硬化形機(jī)制成</p><p>　　

34、動脈粥樣硬化主要是發(fā)生在大中型動脈內(nèi)膜和中膜內(nèi)層，出現(xiàn)了脂質(zhì)沉積、壞死從而形成粥樣物，同時(shí)存在纖維組織和平滑肌細(xì)胞的增生，表現(xiàn)為動脈管壁增厚、變硬，以及彈性減弱和管腔縮小。關(guān)于動脈粥樣硬化的形成機(jī)制存在多種假說：第一種是修飾脂蛋白的多種組分，其中的LDL 氧化產(chǎn)物像氧化磷脂、醛類和溶血磷脂酰膽堿均有導(dǎo)致炎癥發(fā)生的作用，它們會使白細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)組織因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)等等。在動脈粥樣硬化的患者和動物模型都已經(jīng)得到了證實(shí)[6]，就是氧

35、化的LDL 可以誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫的發(fā)生，抗氧化型的 LDL 抗體滴度和頸動脈粥樣硬化的發(fā)展也有一定的相關(guān)。第二種是多種感染因子其中包括巨細(xì)胞病毒、肺炎衣原體和幽門螺旋桿菌，不管是對病灶內(nèi)病原菌的檢測還是流行病學(xué)研究都已經(jīng)證實(shí)了這些病原菌和動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。第三種有的人認(rèn)為動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)來源于自身的免疫，它的抗原可能包括氧化型的 LDL 和肺炎衣原體或者是內(nèi)源性熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs

36、）[7]。</p><p>　　目前眾多研究者傾向于認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種血管慢性炎癥過程，在此過程中血液中單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管壁中膜的平滑肌細(xì)胞均可能發(fā)揮重要作用。血液中的白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮并越過內(nèi)皮細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下層是這一反應(yīng)的早起但關(guān)鍵步驟。除動脈粥樣硬化外，感染性疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種疾病的發(fā)生以及它們的發(fā)展都和細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移有著密切的關(guān)系。在動脈粥樣硬化的形成過程中，泡沫細(xì)胞的形成也

37、被認(rèn)為動脈粥樣硬化一個始動因素[8]。單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮發(fā)生黏附以及隨后發(fā)生的跨內(nèi)皮遷移是形成泡沫細(xì)胞的前提[9]。單核細(xì)胞遷移到內(nèi)皮細(xì)胞下之后，受到內(nèi)皮下脂蛋白的刺激, 逐漸分化為胞內(nèi)含有大量脂質(zhì)成分的泡沫樣的巨噬細(xì)胞，大量的泡沫細(xì)胞聚集形成動脈粥樣斑塊，同時(shí)泡沫細(xì)胞進(jìn)一步了刺激血管平滑肌細(xì)胞的增生，逐漸形成了動脈粥樣硬化條紋[10] 。</p><p>　　1.1.3 白細(xì)胞遷移</p><

38、;p>　　血液中的白細(xì)胞或者組織中的巨噬細(xì)胞在趨化因子作用下能夠向趨化因子濃度高處遷移，進(jìn)而發(fā)揮吞噬作用或者分泌細(xì)胞因子等活性物質(zhì)。在白細(xì)胞遷移過程中，白細(xì)胞自身或者其他細(xì)胞分泌的趨化因子及白細(xì)胞膜上表達(dá)的趨化因子受體發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。</p><p>　　白細(xì)胞的跨越血管內(nèi)皮由血管遷移至外周組織的存在不同的方式，其中在外周血管組織中白細(xì)胞主要是通過跨越內(nèi)皮細(xì)胞的連接部位進(jìn)行遷移（paraendothel

39、ial migration）,例如在外周組織血管（比如像毛細(xì)血管后微靜脈）內(nèi)皮細(xì)胞連接比較疏松，細(xì)胞很容易通過內(nèi)皮細(xì)胞的連接部位，白細(xì)胞主要通過跨越該部位進(jìn)行的遷移，另外一種遷移的方式是穿細(xì)胞遷移（transendothelial migration）。例如在血管內(nèi)皮細(xì)胞連接比較緊密的部位（腦組織的微循環(huán)，特別是血腦屏障），細(xì)胞大多則是通過穿越內(nèi)皮細(xì)胞胞漿的方式進(jìn)行的遷移。</p><p>　　白細(xì)胞無論以哪種方

40、式穿過內(nèi)皮細(xì)胞，均有粘附分子及趨化因子的參與和調(diào)控。</p><p>　　1.1.4 粘附分子和趨化因子</p><p>　　粘附分子是一類能介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的糖蛋白[11]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同為三類；①免疫球蛋白超家族（ immunoglobulin superfamily），其中包括細(xì)胞間粘附分子（inter cellular adhesion molecular-1，ICAM-1、in

41、ter cellular adhesion molecular-2，ICAM-2），血管細(xì)胞粘附分子（vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1 ）。②整合素家族（Intergrin family） 由α鏈和β 鏈組成的異二聚體結(jié)構(gòu)，包括遲發(fā)性抗原1-6 （VLA 1-6），粘附分子1 （Mac-1），P150, 95 （CD11c/ CD18），LFA-1 等。③選擇素超家族(Selec

42、tin superfamily)包括L-選擇素(CD 62 l)、P-選擇素(CD 62 p) 和E-選擇素(CD 62 e)，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處（PECAM，VE-cadenin和CD99）在白細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞間隙時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12]。 </p><p>　　趨化因子和粘附分共同作用于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞之間以及基質(zhì)，共同完成炎癥過程中淋巴細(xì)胞的募集或者是粘附。趨化因子是細(xì)胞因子，現(xiàn)目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)趨化因子有

43、50 多種，根據(jù)兩個半胱氨酸殘基（C）在結(jié)構(gòu)中的數(shù)量以及不同的位置，可將趨化因子分為四類CXC ，CC ，C以及CX3C 。CXC 趨化因子已經(jīng)被證明表達(dá)在T淋巴細(xì)胞，包括白介素淋巴細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor 1，SDF -1），白介素-8（Interleukin 8 Interleukin 8 Interleukin 8 Interleukin 8，IL -8），干擾素-γ 生產(chǎn)

44、因子-10 （Interferon gamma-induced protein 10 ，CXCL10 /IP -10 ）。 CC趨化因子的趨化范圍則適用于T細(xì)胞以及單核細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)活化蛋白（regulated on activation, normal T cell expressed and secreted，RANTES / CCL5），單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic pr</p>&

45、lt;p><b>　　國內(nèi)外研究現(xiàn)狀</b></p><p>　　1.2.1 血糖促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生的可能機(jī)制</p><p>　　國內(nèi)外多數(shù)研究者認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種動脈壁炎癥性疾病，包括內(nèi)皮功能異常，白細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞及遷移至內(nèi)皮下組織（圖1.1）。在一些危險(xiǎn)因素如高血糖、高血壓、高膽固醇血癥、吸煙和高纖維蛋白原血癥等的影響下，血管內(nèi)皮功能出現(xiàn)異常，各

46、種粘附分子、炎癥趨化因子表達(dá)增加，促使炎癥細(xì)胞（主要是單核細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞）向動脈內(nèi)膜遷移。在臨床及尸檢資料中表明[18]，高血壓患者動脈粥樣硬化發(fā)病率明顯比正常人高。這可能是因?yàn)樵诟哐獕旱臅r(shí)候，動脈壁承受了特別高的壓力狀況，內(nèi)膜層和內(nèi)皮細(xì)胞層因此受到了損傷，因而低密度脂蛋白更加容易的進(jìn)入動脈壁，并且刺激了平滑肌細(xì)胞的增生，從而引發(fā)了動脈粥樣硬化。另一方面就是對于高血脂癥，在臨床的資料顯示，動脈粥樣硬化常見于高膽固醇血癥。實(shí)驗(yàn)動物在高

47、膽固醇飼料的飼養(yǎng)下，最終可以引起動脈粥樣硬化。近年來的研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白和極密度脂蛋白的增高和高密度脂蛋白的降低都同動脈粥樣硬化是有聯(lián)系的。血液中的甘油三酯的增高與動脈粥樣硬化的發(fā)生也有聯(lián)系。最新的研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白a〔Lpa）與動脈粥樣硬化的發(fā)生有密切關(guān)系[19]。而對于糖尿病者多數(shù)都有高膽固醇血癥或高甘油三酯血癥，有的還</p><p>　　圖1.1：血管動脈粥樣硬化的形成機(jī)制。血管病變導(dǎo)致內(nèi)膜增生，ap

48、o-E在血管內(nèi)皮下累積，單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞并向內(nèi)皮下遷移，聚集分化形成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞大量攝取ox-LDL并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，向內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成早期動脈粥樣硬化，而動脈粥樣硬化的進(jìn)一步發(fā)展，可導(dǎo)致血栓的形成。</p><p>　　2型糖尿病所致動脈粥樣硬化為多因素作用，單核細(xì)胞在內(nèi)皮下聚集并分化為巨噬細(xì)胞，繼而吞噬氧化型低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞，最終形成粥樣斑塊。動脈粥樣硬化的形成，主要是內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞

49、、淋巴細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞相互作用造成。單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞下形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞凋亡或壞死并釋放脂質(zhì)進(jìn)而形成細(xì)胞外脂核，有纖維帽覆蓋脂質(zhì)核心（膽固醇和膽固醇酯）上，隨著脂核的逐漸增大、纖維帽的變薄以及巨噬細(xì)胞的增多，一些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子、白介素-6、干擾素和基質(zhì)金屬蛋白酶等參與炎癥和斑塊分解作用，可導(dǎo)致斑塊破裂，繼而活化血小板和形成血栓，造成血管狹窄或閉塞[21].因此，免疫細(xì)胞的遷移是動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以往的研究發(fā)現(xiàn)

50、，高糖能降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和細(xì)胞增殖，因而在糖尿病人中常出現(xiàn)傷口愈合緩慢及動脈粥樣硬化的加劇。針對這一現(xiàn)象， Hamuro 等[22]研究發(fā)現(xiàn)高血糖能誘導(dǎo)核因子-κB ( nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，內(nèi)皮細(xì)胞遷移在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中的作用主要表現(xiàn)在兩個方面， 即內(nèi)皮細(xì)胞受損后的再內(nèi)皮</p><p>　　1.2.2 糖尿

51、病和炎癥</p><p>　　目前的研究表明，主要因?yàn)橐葝u素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌不足是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制，長期IR的不足不僅會造成B細(xì)胞功能衰竭，讓血糖升高，也會對糖尿病的大血管病變發(fā)生發(fā)展存在著重要的影響。另外的研究發(fā)現(xiàn)在炎癥的急性時(shí)相蛋白中最敏感的指標(biāo)是C反應(yīng)蛋白(C-RP)，它和IR有著密切關(guān)系，它的增高揭示了糖尿病大血管并發(fā)癥的炎性反應(yīng)機(jī)制，對糖尿病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及臨

52、床治療效果的評估具有一定的價(jià)值。C-RP與冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展以及其后有著非常密切聯(lián)系。在生物學(xué)因子眾多中反映低度炎癥反應(yīng)的C-RP是臨床上最為常用的一個指標(biāo)。它主要是由前炎癥因子白細(xì)胞介素6(IL-6)在刺激下肝臟合成的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白[25]。是作為血漿的一個成分存在的，則在不同的炎癥刺激下，血漿中的C-RP水平會有顯著而且快速的變化，炎癥反應(yīng)的時(shí)候相涉及的程度和C-RP增高的發(fā)生率增高值可能有關(guān)。</p&g

53、t;<p>　　1.2.3 高糖對趨化和粘附因子的影響</p><p>　　動脈粥樣硬化是糖尿病大血管并發(fā)癥的主要病變。動脈粥樣硬化早期病變形成過程中，MCP-1等趨化因子和ICAM-1、VCAM-1等粘附分子起了重要作用[26]。MCP-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞表面介導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮下間隙遷移的趨化因子[27]。ICAM-1和VCAM-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞表面重要的粘附分子，ICAM-1主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋

54、巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附遷移，VCAM-1主要介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附遷移。研究表明，MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等炎性因子過量表達(dá)是冠狀動脈疾病早期的預(yù)報(bào)器[28]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂在糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[29]。在糖尿病及合并冠狀動脈血管病變或合并腎病、視網(wǎng)膜病變等微血管病變中，血漿中MCP-1、ICAM-1、VCAM-1含量顯著增加，而高血糖是主要的

55、危險(xiǎn)因素之一[30]。高糖對內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的上調(diào)作用可能與其自身氧化產(chǎn)生的過多活性氧自由基造成的過氧化壓力增加有關(guān)，與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC） 、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及p38MAPK機(jī)制相關(guān)。尋找可抑制</p><p>　　1.2.4 高糖對內(nèi)皮細(xì)胞影響</p><p>　　糖尿病因伴有嚴(yán)重的大血管和微血管并發(fā)癥而造成患者死亡率增加，其中內(nèi)皮細(xì)胞(EC)功能

56、損害是血管病變起始的關(guān)鍵因素之一。高血糖是糖尿病患者獨(dú)有的檢測指標(biāo)，高血糖對內(nèi)皮細(xì)胞具有影響，血管早期損傷機(jī)制說明情況有助于延遲或阻止糖尿病血管損傷的發(fā)生。我們查閱的文獻(xiàn)中高濃度葡萄糖（Glu）的培養(yǎng)液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞以后[33]，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的增生和黏附分子表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中在對照組（5.5Mm）培養(yǎng)的細(xì)胞和不同的三組高糖濃度（11.2Mm,16.8Mm，33.6Mm）下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長情況的結(jié)果為：在24h的時(shí)候，三組高糖下的細(xì)胞的

57、生長情況都是上升的情況，在72h的時(shí)候細(xì)胞的生長出現(xiàn)了停滯的現(xiàn)象，其細(xì)胞的死亡率明顯的大于對照組死亡的細(xì)胞。對于內(nèi)皮細(xì)胞的受體的表達(dá)的結(jié)論：內(nèi)皮細(xì)胞在三組高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的血管細(xì)胞的粘附分子-1（ICAM-1 ）在48 h和72h后表達(dá)都有明顯的上升趨勢和對照組相比較，但是在三組高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的血管細(xì)胞的粘附因子-1（VCAM-1）和對照組VCAM-1的表達(dá)沒有明顯的差異存在。糖尿病是導(dǎo)致動脈粥樣硬化內(nèi)皮功能損害的主要原因，在動脈

58、粥樣硬化早期，單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞</p><p>　　我們此前的實(shí)驗(yàn)也觀察到高糖環(huán)境能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，但高糖環(huán)境是否能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移的研究并不多。因此，本實(shí)驗(yàn)以Jurkat淋巴細(xì)胞為研究對象，利用transwell小室，研究高糖是否影響淋巴細(xì)胞的遷移。</p><p>　　1.3 論文構(gòu)成及研究內(nèi)容</p><p>　　1.3.1 研究內(nèi)容

59、</p><p>　　不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液對淋巴細(xì)胞增值的影響；</p><p>　　不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液對淋巴細(xì)胞遷移的影響；</p><p>　　1.3.2 論文構(gòu)成</p><p>　　本論文由研究背景、研究方法、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論的幾部分構(gòu)成。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)方法</b>

60、;</p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat cell line，在體外實(shí)驗(yàn)中可作為T淋巴細(xì)胞株使用。細(xì)胞培養(yǎng)液： RPMI1640+10%FCS+1%PS，青霉素100IU/ml，鏈霉素100IU/ml。培養(yǎng)于5%CO2，3

61、7oC細(xì)胞培養(yǎng)箱中。</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p><b>　　(1)常用試劑</b></p><p>　　RPMI 1640 培養(yǎng)基：Sigma，美國</p><p>　　胎牛血清：四季青，杭州</p><p>　　青霉素（10000units/ml）：Sigma，美

62、國</p><p>　　鏈霉素（10000μg/ml）：Sigma，美國</p><p>　　胰蛋白酶： Ameresco，美國</p><p>　　二甲基亞砜（DMSO）：Sigma，美國</p><p>　　氯化鉀（ KCl ），磷酸二氫鉀（ KH 2PO 4），氯化鈉（ NaCl ），磷酸氫二鈉（Na2HPO4）， 購自北京化學(xué)試劑廠。

63、</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)常用耗器材</p><p>　　T25培養(yǎng)瓶：Corning ，美國</p><p>　　24孔板：Corning，美國</p><p>　　Transwell小室：Greiner，德國</p><p><b>　　離心管和無菌槍頭</b></p>

64、<p>　　2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　普通倒置光學(xué)顯微鏡：ELWDN.A.0.30，Motic AE31公司，日本</p><p>　　pH計(jì)：pH/ISEmeter-86805，ORION公司，美國</p><p>　　超純靜水器：KQ250E，Utrawave Wash Machine公司，北京 </p><p&

65、gt;　　恒溫磁力攪拌器：85- 2型，司樂儀器有限公司，上海</p><p>　　電子天平： Sartorius公司，德國</p><p>　　高壓滅菌箱： ALP公司，日本</p><p>　　直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱：Thermo Form公司，美國</p><p>　　-80 oC 冰箱：Thermo Form公司，美國</p>

66、;<p>　　離心機(jī)（室溫離心機(jī)） ：中國</p><p>　　2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用各種溶液的配置</p><p>　?。?）RPMI 1640培養(yǎng)液：</p><p>　　一袋RPMI 1640粉末，加2.0 g碳酸氫鈉，三蒸水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4，定溶至1000ml，過濾除菌后分裝。</p><p>　?。?）10% RP

67、MI 1640完全培養(yǎng)液：</p><p>　　在RPMI1640的培養(yǎng)液加入滅活的10%胎牛血清，另外添加青-鏈霉素5.5ml（培養(yǎng)液中濃度：青霉素100 units/ml， 鏈霉素100μg/ml），無菌條件下配制，充分混合均勻于 4oC保存。</p><p><b>　?。?）胎牛血清：</b></p><p>　　購買的瓶裝血清，在使用

68、前進(jìn)行滅活，首先將凍存的500mL 瓶裝血清放置于37 oC水浴鍋中化凍，然后將水浴鍋溫度調(diào)至56oC滅活30分鐘后于無菌條件下裝， 并標(biāo)記20oC儲存。</p><p><b>　?。?）細(xì)胞凍存液：</b></p><p>　　完全培養(yǎng)液、胎牛血清、DMSO按6:3:1比例于凍存前配置。</p><p>　?。?）PBS緩沖液（pH 7.2

69、~7.4） </p><p>　　用電子天平稱取氯化鈉 8g 、氯化鉀 0.2g 、磷酸二氫鉀 0.27g 、磷酸氫二鈉 1.42g 放入燒杯，加去離子水800 毫升，用玻璃棒或者振蕩器使溶劑充分解然后加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH為7.4 ，最后定容到1L 。用高壓鍋溫滅菌，待恢復(fù)常保存至4oC冰箱備用。</p><p>　?。?）高糖和低糖培養(yǎng)液</p><p>　　高糖（

70、22.2Mm）：50mlRPMI 1640（無糖）+10%胎牛血清+400μl葡萄糖</p><p>　　低糖（5.5Mm）：50mlRPMI 1640（無糖） +10%胎牛血清+100μl葡萄糖</p><p>　?。?）0.25% 胰蛋白酶的配置</p><p>　　用電子天平稱取 0.25g 胰蛋白酶粉末，放入100ml PBS中，胰蛋白酶完全溶解后在無菌條件

71、下用 0.2μm濾器過濾，并且分裝標(biāo)記置于 -20oC保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)</p><p>　?。?）細(xì)胞凍存（慢凍） </p><p>　　選對數(shù)生長期細(xì)胞，在收集細(xì)胞前24h換液，離心收集細(xì)胞并用新配置的凍存液重懸。密度

72、為1×106/m，每凍存管中放1~1.5ml，做好標(biāo)記，在4 oC 1h，-20oC 1h，-80oC過夜后迅速放入液氮罐中長期保存。Jurkat凍存時(shí)細(xì)胞數(shù)易控制在5~10×106/ml，凍存細(xì)胞數(shù)過少則不易復(fù)蘇。</p><p>　?。?）細(xì)胞復(fù)蘇（速溶） </p><p>　　從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37 oC水浴中（1-2分鐘），其凍存管里的凍存液融化差不

73、多還有小許的冰取出后將其加入到10倍體積的PBS中離心（800r/min，5min），將上清去掉，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，放在37oC，5%CO2次日再進(jìn)行換液。細(xì)胞復(fù)蘇的過程是需要非常迅速的，Jurkat細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)死細(xì)胞較多，可按1:2傳代3~4次，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好。 </p><p><b>　?。?）細(xì)胞傳代</b></p><p>　

74、　細(xì)胞的生長狀態(tài)良好后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，在進(jìn)行30分鐘滅菌的操作臺上，將T25中的液體輕輕的搖晃，使其細(xì)胞得到充分的均勻，用1ml的無菌搶頭取出0.5ml或者1ml放到新的T25培養(yǎng)瓶中，并且加入新的10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液使其達(dá)到5ml，置于37oC，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2-3天的培養(yǎng)，細(xì)胞長到致密狀態(tài)的時(shí)候，在進(jìn)行傳代。</p><p>　　（4）低糖和高糖環(huán)境下的培養(yǎng)</p

75、><p>　　將生長狀態(tài)良好的Jurkat淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后分別取出細(xì)胞的密度為1×105/ml的細(xì)胞放在15ml的移液管進(jìn)行（800r/min，5min）的離心，并將上清液去掉，分別加入1ml的低糖和高糖的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞的重懸過程，分別拿出兩個T25的培養(yǎng)瓶加入4ml的低糖和高糖培養(yǎng)液，在將15ml移液管中的1ml低糖和高糖分別再到T25的培養(yǎng)瓶中，置于37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行24h的培養(yǎng)

76、</p><p>　　2.2.2 遷移實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　(1)確定遷移時(shí)間</b></p><p>　　Jurkat細(xì)胞分別在低糖和高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞計(jì)數(shù)后離心然后以新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，各取500µl培養(yǎng)液（上清）放入24孔培養(yǎng)板中（下室），將transwell（上室）置入24孔板，此時(shí)transwel

77、l底面剛好接觸下室中培養(yǎng)液，上室內(nèi)分別加入低糖和高糖培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞200µl，細(xì)胞總數(shù)為5× 個，24孔培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔2小時(shí)光鏡下觀察Jurkat細(xì)胞遷入下室情況，12h后細(xì)胞開始遷移至下室，以后實(shí)驗(yàn)中將遷移時(shí)間設(shè)置為12h。</p><p><b>　?。?）遷移實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　不同濃度葡萄糖條件下的遷移：

78、Jurkat細(xì)胞在5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)所需時(shí)間，收集細(xì)胞離心并計(jì)數(shù)，分別取500µl培養(yǎng)液放入24孔板，各取新鮮培養(yǎng)液重懸的Jurkat細(xì)胞1×105個加入上室transwell中，遷移12h，光鏡下隨機(jī)選取9個10倍鏡視野計(jì)數(shù)，并行2孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 </p><p>　　高濃度葡萄糖培養(yǎng)不同時(shí)間后的遷移：Jurkat細(xì)胞在22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)12、24

79、、48h，收集細(xì)胞離心并計(jì)數(shù)細(xì)胞，將各時(shí)間點(diǎn)條件培養(yǎng)液500µl加入24孔板下室，上室加入1×105個正常傳代的Jurkat細(xì)胞，考察條件培養(yǎng)液對正常傳代的Jurkat細(xì)胞遷移的影響；為考察高糖培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞的遷移特性的變化，在24孔板下室中加入普通細(xì)胞培養(yǎng)液500µl，以無血清培養(yǎng)液重懸上述離心所獲細(xì)胞，加入transwell上室，1×105/孔，遷移12h。計(jì)數(shù)方法同上。</p&

80、gt;<p>　　圖2.1 利用Transwell檢測細(xì)胞遷移。左圖為Transwell使用示意圖，右圖為加入Transwell中的Juark細(xì)胞</p><p>　　2.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析</p><p>　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，運(yùn)用Excel軟件作圖，組件差異，進(jìn)行T檢驗(yàn)。P<0.05表示具有顯著差異。</p><p&

81、gt;　　2.2.4 注意事項(xiàng)</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過程中我們遇到了幾個問題，前期細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞在經(jīng)過兩次傳代后會出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，不久細(xì)胞就會死亡。我們初步懷疑是培養(yǎng)液的問題，因此培養(yǎng)液全部重新進(jìn)行了過濾，在過濾之后，細(xì)胞依舊會出現(xiàn)分化的狀態(tài)。我們向長期養(yǎng)Jurkat細(xì)胞的學(xué)姐進(jìn)行了詢問，學(xué)姐之前沒有遇到這樣的情況，因此我們在進(jìn)行傳代的時(shí)候，讓學(xué)姐操作我們進(jìn)行了詳細(xì)的觀察，研究在細(xì)胞傳代過程的我

82、們的不同點(diǎn)。后來發(fā)現(xiàn)在操作上的區(qū)別在于我在細(xì)胞傳代的時(shí)候，將細(xì)胞放置在離酒精燈很近的地方，由于溫度過高，細(xì)胞產(chǎn)生分化然后死亡，這個問題給了我很大的啟示，雖然看似一個很小的操作上的區(qū)別，可以導(dǎo)致細(xì)胞的生長的好與壞。也因?yàn)檫@個小小的操作上的失誤，我們進(jìn)行了反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，雖然最終找的問題的所在，但是同時(shí)我們不僅浪費(fèi)了很多實(shí)驗(yàn)材料也同樣浪費(fèi)了很多的時(shí)間。因此，在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)我們應(yīng)該時(shí)刻的注意這些小的細(xì)節(jié)。以免會造成更大的不便。在進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，

83、由于實(shí)驗(yàn)室很多的細(xì)胞發(fā)生了污染的現(xiàn)象，我們的細(xì)胞被污染，因此我們進(jìn)行了重新復(fù)蘇細(xì)胞的工作，在復(fù)蘇過程中，我們的培養(yǎng)液也進(jìn)行了重新的配置，復(fù)蘇的細(xì)胞依舊出現(xiàn)污染，我們進(jìn)行培養(yǎng)液的過濾后，這種污染的現(xiàn)</p><p>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論</p><p><b>　　3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1.1 不同濃度葡萄糖對Ju

84、rkat細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　將正常傳代的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，分別在5.5mM和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，細(xì)胞密度為1×105個/ml，結(jié)束培養(yǎng)后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，檢測不同濃度葡萄糖是否影響Jurkat增值。從圖3.1可以看出，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后5.5mM組細(xì)胞由5×105個增至1×106個，22.2mM組細(xì)胞由5×105個增至9.6×

85、;105個，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明22.2mM葡萄糖培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞24小時(shí)對細(xì)胞增至無明顯影響。</p><p>　　Jurkat細(xì)胞在5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。n=3.</p><p>　　圖3.1 不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞增殖的影響。</p><p>　　3.1.2不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞遷移的影響&

86、lt;/p><p>　　為檢測不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞遷移的影響，我們將Jurkat細(xì)胞分別在5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，隨后利用transwell小室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，下室中的培養(yǎng)液為上述已經(jīng)分別培養(yǎng)細(xì)胞24h的5.5和22.2mM葡萄糖條件培養(yǎng)液。結(jié)果顯示，經(jīng)12h遷移后，22.2mM葡萄糖組Jurkat細(xì)胞遷移入下室的細(xì)胞數(shù)為11.3個（每10倍鏡視野），5.5mM組細(xì)胞數(shù)為31.6個（每

87、10倍鏡視野），明顯多于前者。影響細(xì)胞遷移的因素主要包括下室中的趨化因子量和Jurkat細(xì)胞自身所表達(dá)的趨化因子受體。隨后我們初步檢測了不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞遷移的可能作用靶點(diǎn)。</p><p>　　Jurkat細(xì)胞在在5.5Mm和22.2Mm葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，向transwell小室中加入5×104個細(xì)胞，遷移12h后光鏡下計(jì)數(shù)遷移入下室的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以每10倍鏡視野下

88、遷移的細(xì)胞數(shù)表示。*, P<0.05, 22.2mM組遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于5.5mM組。n=3.</p><p>　　圖3.2 不同濃度葡萄糖對Jurkat細(xì)胞遷移的影響。</p><p>　　3.1.3高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)液對Jurkat細(xì)胞遷移的影響</p><p>　　為了明確高濃度葡萄糖環(huán)境下的Jurkat細(xì)胞遷移減少是否因?yàn)橼吇蜃臃置跍p少所致，我們檢

89、測了不同濃度葡萄糖的條件培養(yǎng)液（分別培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞24h后離心所得的培養(yǎng)液）對相同Jurkat細(xì)胞（5.5mM葡萄糖培養(yǎng)）的趨化能力。如圖3.3所示，與5.5mM葡萄糖條件培養(yǎng)液相比，22.2mM條件培養(yǎng)液中遷移的Jurkat細(xì)胞數(shù)顯著減少，由此我們推測高濃度葡萄糖有可能抑制Jurkat細(xì)胞分泌趨化因子，從而影響細(xì)胞的遷移。</p><p>　　為了驗(yàn)證這一猜想，我們將Jurkat細(xì)胞在22.2mM培養(yǎng)液中

90、分別培養(yǎng)12h、24h、48h，離心獲得條件培養(yǎng)液，檢測條件培養(yǎng)液對普通傳代的Jurkat細(xì)胞的趨化能力。雖然與12h相比，24h條件培養(yǎng)液中遷移的細(xì)胞數(shù)量有減少傾向，但48h條件培養(yǎng)液中遷移的細(xì)胞數(shù)則與12h相似（圖3.4）。因?yàn)闂l件所限，實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了一次，未能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。今后的研究中通過ELISA等方法檢測培養(yǎng)液中分泌的趨化因子量有助于我們?nèi)媪私飧邼舛绕咸烟菍α馨图?xì)胞趨化因子分泌的影響。另外Jurkat細(xì)胞在48h時(shí)數(shù)量增加明

91、顯，檢測趨化因子分泌量時(shí)需要考慮到細(xì)胞數(shù)量變化對條件培養(yǎng)液中分泌蛋白量的影響。</p><p>　　5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞24h，離心收集條件培養(yǎng)液加入下室中，transwell上室中加入5×104個對照組Jurkat細(xì)胞，遷移12h鏡下計(jì)數(shù)遷移入下室內(nèi)的細(xì)胞。*, P<0.05. 22.2mM組遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于5.5mM組。n=3.</p><

92、p>　　圖3.3不同濃度葡萄糖條件培養(yǎng)液對Jurkat細(xì)胞遷移的影響。</p><p>　　Jurkat細(xì)胞在22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)12h、24h、48h，離心獲得條件培養(yǎng)液加入各下室內(nèi)，transwell上室內(nèi)加入普通傳代Jurkat細(xì)胞，遷移12h后光鏡下計(jì)數(shù)遷移入下室的細(xì)胞。</p><p>　　圖3.4高糖條件培養(yǎng)液對Jurkat細(xì)胞遷移的影響。</p>

93、;<p>　　3.1.4高濃度葡萄糖培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞遷移特性的改變</p><p>　　除了驗(yàn)證高糖環(huán)境是否影響Jurkat細(xì)胞分泌趨化因子外，我們還初步檢測了高糖培養(yǎng)是否可能影響Jurkat細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá)。將Jurkat細(xì)胞在5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，離心加入transwell上室，下室內(nèi)加入22.2mM高糖條件培養(yǎng)液，檢測經(jīng)不同濃度葡萄糖負(fù)荷后Jurkat細(xì)胞遷

94、移情況。結(jié)果如圖3.5所示，與低糖負(fù)荷的Jurkat細(xì)胞相比，22.2mM葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞遷移入下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于前者，提示高糖負(fù)荷除可能影響Jurkat細(xì)胞分泌趨化因子外，還可能影響細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)。</p><p>　　隨后我們將Jurkat細(xì)胞在22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)了12h、24h和48h，并檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果如圖3.6所示，與對照組和12h高糖負(fù)荷細(xì)胞相比，高糖負(fù)荷24h后

95、Jurkat細(xì)胞遷移數(shù)量呈現(xiàn)減少傾向，但48h組遷移細(xì)胞數(shù)與12h組類似。同樣次遷移實(shí)驗(yàn)也只進(jìn)行了一次，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以明確高糖對淋巴細(xì)胞遷移能力的影響，應(yīng)用特異性趨化因子受體抗體有助于我們了解Jurkat細(xì)胞表面的趨化因子是否因高糖負(fù)荷而發(fā)生變化。</p><p>　　Jurkat細(xì)胞分別培養(yǎng)與5.5和22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中24h，離心并將細(xì)胞加入transwell上室，下室加入22.2

96、mM條件培養(yǎng)液，遷移12h，光鏡下計(jì)數(shù)遷移入下室的Jurkat細(xì)胞。*, P<0.05, 22.2mM葡萄糖負(fù)荷的Jurkat細(xì)胞遷移明顯少于5.5mM組細(xì)胞。 n=3.</p><p>　　圖3.5高糖對Jurkat細(xì)胞遷移能力的影響</p><p>　　Jurkat細(xì)胞在22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)12h、24h、48h，細(xì)胞離心后以22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液（無血清）重懸，

97、加入transwell上室，下室內(nèi)加入22.2mM葡萄糖培養(yǎng)液，遷移12h，光鏡下計(jì)數(shù)遷移入下室的細(xì)胞。</p><p>　　圖3.6 高糖對Jurkat細(xì)胞遷移能力的影響</p><p><b>　　3.2 討論</b></p><p>　　我們此次進(jìn)行的高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響的到的結(jié)論是高糖對淋巴細(xì)胞的遷移有抑制作用。和之前實(shí)驗(yàn)都表明的高

98、糖能夠促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移的實(shí)驗(yàn)是不一樣的[40]。是否高糖對不同血細(xì)胞的遷移產(chǎn)生的影響不同，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。無論在炎癥還是動脈粥樣硬化形成過程中單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮繼而發(fā)生跨內(nèi)皮遷移都是非常重要的步驟[41]，我們此前的實(shí)驗(yàn)曾經(jīng)觀察到高糖能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但對其遷移并未表現(xiàn)出相應(yīng)的促進(jìn)作用，這需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及對其發(fā)生機(jī)制的深入研究。</p><p>　　淋巴細(xì)胞在粘附

99、、遷移過程中涉及包括趨化因子及其受體、細(xì)胞粘附因子—整合素在內(nèi)的多種活性物質(zhì)。其中與淋巴細(xì)胞趨化相關(guān)的趨化因子包括MCP-1和RANTES，主要由激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放，淋巴細(xì)胞本身也能分泌這些趨化因子，此外淋巴細(xì)胞膜表達(dá)相應(yīng)受體包括CCR2、CCR5等，通過與相應(yīng)趨化分子的結(jié)合介導(dǎo)淋巴細(xì)胞趨化。有研究發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)中講到糖尿病病人的淋巴細(xì)胞在紊亂的生長條件下分裂增殖的時(shí)間比正常人的長，為了進(jìn)一步的了解病人的細(xì)胞分裂時(shí)間延長是因?yàn)楦咛堑脑?/p>

100、，用高濃度的糖進(jìn)行了比較證實(shí)了高糖會延長淋巴細(xì)胞的生長周期，延緩細(xì)胞分裂[42]。另外的研究指出[43]。在糖尿病病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的分布，胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8值明顯的降低，非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM）的淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD4/CD8明顯降低，但是CD8沒有顯著變化。</p><p>　　本研究中5.5mM和22.2mM葡萄糖在

101、培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞24h時(shí)，對細(xì)胞的增殖無顯著影響。此前有研究發(fā)現(xiàn)[44]，高糖對內(nèi)皮細(xì)胞增殖是有影響的，研究主要針對了正常人和2型糖尿病病人的內(nèi)皮組細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的數(shù)值變化，實(shí)驗(yàn)當(dāng)中葡萄糖濃度分別為0、5和33mM，EPCs在這些糖濃度下進(jìn)行了48h的培養(yǎng)，然后通過Annexin-V/PI的檢測方法，檢測EPCs的凋亡率。檢測的結(jié)果顯示出在葡萄糖為0和5 mM的時(shí)候和正常對

102、照組中EPCs的數(shù)量沒有明顯的差別，然而葡萄糖為33 mM的時(shí)候，EPCs的凋亡率明顯的增加，因此文章中明確指出，高糖對糖尿病患者EPCs的作用表現(xiàn)為使其增殖減低，凋亡增加。當(dāng)糖尿病患者血糖控制不良時(shí)，由于這樣的作用因而使EPCs功能下降，不能較好分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，因而血管修復(fù)作用明顯減弱，可能是導(dǎo)致患者易于發(fā)生血管病變及傷口愈合不良的原因之一。另一篇文獻(xiàn)中[45]，對于高糖對EPCs在外周血當(dāng)中的數(shù)量、增值還有它的遷移功能的影響，做

103、了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中先用密度梯度離心法獲得了外周血單個核細(xì)胞，培養(yǎng)7天以后收集貼</p><p>　　另外我們觀察到22.2mM葡萄糖負(fù)荷24h的Jurkat細(xì)胞遷移數(shù)少于5.5mM組細(xì)胞，提示高糖負(fù)荷可能抑制淋巴細(xì)胞遷移。雖然高糖對淋巴細(xì)胞的遷移研究較少，有研究顯示高糖能夠促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移，但這些研究中的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)多在下室添加了趨化因子，研究者在葡萄糖15mM、25mM的作用下對單核細(xì)胞的遷移進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，經(jīng)

104、過12h、24、48h的觀察，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖15mM和25mM下單核細(xì)胞的遷移的數(shù)量都上升的，并且隨著時(shí)間的延長顯著增長，這可能是因?yàn)楦咛菍?nèi)皮細(xì)胞MPC-1的產(chǎn)生影響改變它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增加了MPC-1mRNA和MPC-1的分泌，誘導(dǎo)了單核細(xì)胞的聚集，因而使實(shí)驗(yàn)中單核細(xì)胞遷移數(shù)量增加。同樣這個研究也指出了MPC-1也會誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增值和遷移，從而影響脂質(zhì)的代謝，增加細(xì)胞間質(zhì)膠原的合成參與動脈粥樣硬化的形成[46]。另外對大鼠體內(nèi)的

105、單核細(xì)胞也做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，大鼠經(jīng)過6周的培養(yǎng)后去頸動脈的血進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)正常大鼠的MCP-1的蛋白表達(dá)非常的弱，但是具有2型糖尿病的大鼠中的MCP-1的表達(dá)明顯的增加我們的實(shí)驗(yàn)沒有另外添加趨化因子，這樣更可以明確的指出在高糖下內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MCP-</p><p>　　本次試驗(yàn)并未檢測培養(yǎng)液中趨化因子的分泌量以及Jurkat細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)是否收到高糖的影響，僅僅是根據(jù)Jurkat細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中遷移的

106、情況推斷Jurkat細(xì)胞分泌的趨化因子和細(xì)胞表達(dá)的受體均有可能收到高糖條件的影響，另外血管中的淋巴細(xì)胞向血管外遷移時(shí)需要跨過血管內(nèi)皮細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)質(zhì)檢測了淋巴細(xì)胞的遷移，未涉及內(nèi)皮細(xì)胞，還有我們的實(shí)驗(yàn)僅觀察了高糖負(fù)荷24小時(shí)的影響，缺少對更多時(shí)間點(diǎn)的觀察，這些都是在今后的工作中需要注意的。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　本研究檢測了5.5

107、mM和22.2mM葡萄糖負(fù)荷24h對Jurkat細(xì)胞增殖和遷移的影響。研究結(jié)果表明：</p><p>　　高糖和低糖對Jurkat細(xì)胞的增殖無明顯影響；</p><p>　　高糖對Jurkat細(xì)胞遷移起抑制作用。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　歷時(shí)3個月的畢業(yè)設(shè)計(jì)進(jìn)入尾聲，回想剛剛開始做實(shí)

108、驗(yàn)時(shí)的無知和魯莽，還有3個月來遇到的每次困難和每次解決問題后的收獲，我感慨萬千。</p><p>　　因?yàn)槲业漠厴I(yè)設(shè)計(jì)和綜合實(shí)驗(yàn)一直都是做的高糖對淋巴細(xì)胞遷移的影響，因此在細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)上沒有很大的問題，首先的非常感謝桑晨老師在綜合實(shí)驗(yàn)的時(shí)候就一點(diǎn)一滴的教了我許多關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)所應(yīng)該學(xué)會的事項(xiàng)，讓我可以很快的在下半年的畢業(yè)設(shè)計(jì)中開始我的實(shí)驗(yàn)，雖然在實(shí)驗(yàn)中遇到了許多的問題，都是通過桑老師的建議一步步改正過來的。實(shí)驗(yàn)的

109、設(shè)計(jì)桑老師也提出了很多寶貴的意見。在論文撰寫也得到桑老師的指導(dǎo)和幫助下完成的，在此我以最誠摯的敬意感謝我的導(dǎo)師，感謝她在自我大三暑期實(shí)踐進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室以來的這1年多來對我的指導(dǎo)、鼓勵和關(guān)懷。整個畢業(yè)設(shè)計(jì)從選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，到具體的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果的分析，最后畢設(shè)論文的撰寫及論文的修改，都得到了桑老師耐心細(xì)致的指導(dǎo)，以及不斷的鼓勵。桑老師的悉心幫助不僅幫助我順利完成畢業(yè)設(shè)計(jì)，還讓我學(xué)會了一定的科研思路，學(xué)會了自己分析問題、處理問題，為我將來的學(xué)習(xí)和工