貝前列素鈉對高糖損傷大鼠系膜細胞的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景:
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)特有的微血管并發(fā)癥之一，其特征性的病理改變包括系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積、腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致進行性尿蛋白/白蛋白排泄的增加和腎功能的下降。DN的發(fā)病機制復(fù)雜，目前認為高血糖、腎血流動力學(xué)的異常、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glyca

2、tion endproducts，AGEs)的增多、多元醇及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途徑的激活、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生等多種因素共同參與了DN的發(fā)生與發(fā)展。如何對糖尿病腎病進行有效地防治一直是臨床關(guān)注的熱點與難點。
　　 腎小球系膜細胞(mesangial cell，MC)是腎小球最重要的固有細胞之一，對維持腎小球毛細血管床的完整性與系膜基質(zhì)代謝平衡起到了重要的作用。在DN的發(fā)病中，各種病理因素直接作用于M

3、C，引起MC肥大與過度增殖，系膜區(qū)膠原纖維(collagen)、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等ECM成分異常的聚集沉積，構(gòu)成了DN腎小球硬化重要的病理基礎(chǔ)。持續(xù)的細胞外高糖，以及高糖介導(dǎo)的各種病理因素還可以通過腎小球內(nèi)皮細胞、足細胞、炎癥細胞與MC相互作用，產(chǎn)生細胞因子與炎癥介質(zhì)，通過“自分泌”、“旁分泌”等方式影響MC，介導(dǎo)并促進了腎小球纖維化向腎小球硬化的進展。
　　 在DN腎小球硬化的病理過程中，轉(zhuǎn)化生長因

4、子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是重要的腎臟致纖維化的標志之一。MC能夠分泌TGFβ1，并具有高親和力的TGFβ1受體。因而TGFβ1能夠通過“自分泌”、“旁分泌”的方式發(fā)揮其促進腎臟纖維化的作用。細胞外高糖以及高糖介導(dǎo)的各種病理因素均可作為促纖維化因素作用于MC促進TGFβ1的合成與分泌，激活TGFβ1下游Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族，促進ECM的產(chǎn)生并抑制其降解。
　　 除了TGF

5、β1/Smads介導(dǎo)的DN腎纖維化經(jīng)典途徑外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路可以獨立的或與TGFβ1/Smads通路相互作用，參與DN的發(fā)病。MAPK通路主要包括細胞外信號調(diào)控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates,ERK)、c-JunN端激酶(c-junamino-terminal kinase，JN

6、K)/應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK等途徑，是細胞將信號從細胞外傳遞到細胞內(nèi)的主要通路。糖尿病高糖狀態(tài)下，多元醇途徑的激活、蛋白質(zhì)非酶糖化，PKC途徑的激活以及氧化應(yīng)激水平的增加均可導(dǎo)致MAPK的激活，磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達，參與DN的發(fā)生發(fā)展。
　　 糖尿病腎病的病理狀態(tài)下，在MC過度增殖、系膜區(qū)ECM異常增多的同時，還伴有多種細胞因子

7、和炎癥介質(zhì)分泌的增加，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的激活，加速了腎小球硬化的過程和腎病的進展。糖尿病本身是一個慢性炎癥的過程并由此引起巨噬細胞在多個組織中聚集。這種巨噬細胞的聚集與糖尿病疾病狀態(tài)、炎癥的激活及DN腎損傷的進展關(guān)系密切。大量研究表明，單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)在糖尿病組織巨噬細胞浸潤及炎癥中起到了關(guān)鍵作用。
　　 MCP-1是一種能被多種細胞表達的，

8、對單核細胞、T淋巴細胞等具有趨化作用的分泌型蛋白。MCP-1與其受體結(jié)合后，誘導(dǎo)下游黏附分子的表達，使單核細胞/巨噬細胞等向病變部位聚集而發(fā)揮其病理作用。高糖培養(yǎng)系膜細胞能夠通過PKC與氧化應(yīng)激的激活促進MCP-1的表達。阻斷MCP-1與其受體結(jié)合能減少糖尿病小鼠腎組織巨噬細胞的浸潤及TGFβ1、IV膠原的表達，有效地阻止DN腎小球硬化的進展。
　　 前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)是前列腺素(prostaglan

9、din，PG)家族中的重要成員，主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，具有強大的舒張血管平滑肌、擴張血管及抗血小板凝聚的作用。體內(nèi)的細胞膜磷脂被磷脂酶A2水解為花生四烯酸，后者進一步在環(huán)氧合酶與前列環(huán)素合成酶的作用下逐步合成PGI2。PGI2合成后通過與兩類受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用:1）與細胞膜上G蛋白偶聯(lián)的膜受體IP結(jié)合，主要激活下游的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)途徑發(fā)揮舒張血管、抗血小板凝聚及抗纖

10、維化等作用;2）與細胞核過氧化物酶體增殖激活受體β/δ(peroxisome proliferator-activated receptorβ/δ，PPARβ/δ)結(jié)合，通過PPAR特異的反應(yīng)元件PPRE(PPAR responsive element)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。PGI2的性質(zhì)十分不穩(wěn)定，37℃時半衰期僅4min，很快轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的無活性的代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素。目前主要通過與PGI2有相似藥理作用的人工合成的各種PGI2類似物

11、來研究PGI2的作用機制。
　　 貝前列素鈉（beraprost sodium，BPS）將PGI2結(jié)構(gòu)中的外烯醇醚結(jié)構(gòu)替換為環(huán)戊烷苯并呋喃酮結(jié)構(gòu)，體內(nèi)半衰期延長至60min，口服途徑給藥仍保留了與PGI2相似的藥理作用。體外研究表明，BPS通過增加系膜細胞內(nèi)cAMP水平抑制機械遷張拉力對MAPK的激活從而抑制FN的表達，減輕腎小球內(nèi)高壓對MC的損傷作用;還能夠抑制高糖誘導(dǎo)的MC的增殖、IV膠原的合成并提高MC的抗氧化能力。動物實

12、驗結(jié)果顯示，BPS喂養(yǎng)OLETF大鼠后，其腎小球體積及硬化指數(shù)明顯低于對照組，腎小球內(nèi)AGEs的形成及巨噬細胞浸潤明顯減少，同時伴有尿蛋白排泄率及血清尿素氮的降低。在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠中，BPS通過調(diào)節(jié)入球小動脈內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶活性抑制了DM狀態(tài)下入球小動脈的擴張，減輕了腎小球的高濾過，同時還抑制了巨噬細胞的浸潤。早期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，BPS能夠抑制糖尿病患者血清血栓調(diào)節(jié)蛋白水平，通過減輕AngⅡ?qū)Τ銮蛐用}的收縮作用、緩解腎小球的

13、高濾過狀態(tài)，降低糖尿病患者尿白蛋白的排泄。這些結(jié)果提示BPS具有一定的腎臟保護作用。因而，BPS作為一種可以口服的PGI2類似物，在糖尿病腎病的防治中具有廣泛地應(yīng)用前景，進一步研究BPS腎臟保護的作用機制，具有十分重要的臨床意義。
　　 因此在本研究中，我們探討了PGI2類似物貝前列素鈉(BPS)對高糖環(huán)境下大鼠系膜細胞株HBZY-1細胞ECM合成與降解的作用，對趨化因子MCP-1表達的影響，以及對細胞內(nèi)信號通路的影響，以闡明貝

14、前列素鈉對腎臟保護作用的可能機制，為貝前列素鈉用于糖尿病腎病的臨床防治提供部分理論依據(jù)。
　　 第一章貝前列素鈉對高糖環(huán)境下大鼠系膜細胞ECM合成的影響
　　 目的:
　　 1.觀察不同濃度BPS對高糖環(huán)境下大鼠細胞系膜細胞株HBZY-1增殖活性的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1、FN及MMP-2蛋白質(zhì)表達的影響。
　　 3.觀察不同濃度BPS對高糖環(huán)境下

15、HBZY-1細胞TGFβ1、FN及MMP-2mRNA水平表達的影響。
　　 4.探討p38 MAPK、ERK信號通路是否參與了BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞ECM合成的調(diào)節(jié)。
　　 5.探討B(tài)PS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1/Smad3信號通路的影響。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng):采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1

16、。
　　 2.細胞處理分組:正常葡萄糖濃度組(NG組，葡萄糖濃度5.6mmol/L)，高葡萄糖濃度組（HG組，葡萄糖濃度30mmol/L），HG聯(lián)合不同濃度的BPS組:BPS藥物處理濃度分別為0.1umol/L(uM)，0.5 uM，1uM，2uM，5uM,10uM。
　　 3.不同處理組(NG組，HG組，HG分別聯(lián)合不同濃度的BPS組)體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h，48h用MTT法測定細胞增殖活性。
　　

17、 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h，48h收集細胞培養(yǎng)上清液，用Elisa法測定細胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1、FN及MMP-2蛋白質(zhì)的表達量。
　　 5.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h收集細胞，用實時熒光定量(real-time) PCR法測定細胞TGFβ1、FN及MMP-2 mRNA的相對表達量(2-△△Ct)。
　　 6.應(yīng)用免疫印跡法分別檢測0min，15min，30min，60min，

18、90min不同時間點HG培養(yǎng)條件下HBZY-1細胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白的表達。
　　 7.分別選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白表達最顯著的時間點，應(yīng)用免疫印跡法分別檢測該時間點HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白的表達。
　　 8.應(yīng)用免疫印跡法分別檢測0min，15min，30min，60min，90min不同時間點HG培養(yǎng)條件下HBZ

19、Y-1細胞smad3磷酸化蛋白的表達。
　　 9.選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細胞smad3磷酸化蛋白表達最顯著的時間點，應(yīng)用免疫印跡法檢測該時間點HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細胞smad3磷酸化蛋白的表達。
　　 10.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用析因方差分析方法進行主效應(yīng)和交互效應(yīng)的分析;多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-w

20、ay ANOVA)，多重比較采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齊時，用Welch法校正，多重比較采用Dunnett's T3法;兩獨立樣本比較采用t檢驗。P≤0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞增殖活性的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)24h，48h后各組細胞O.D.值均有顯著差異(24h:F

21、=5.977，P＜0.001;48h:F=25.585，P＜0.001)。與NG組相比，HG組培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細胞O.D.值均顯著增加（P均＜0.001）。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞24h及48h，與HG組相比，除HG+0.1 uMBPS組外，其余5個BPS濃度處理組O.D.值均顯著低于HG組(24h: P=0.044;48h: P＜0.001)。
　　 根據(jù)本組實驗的結(jié)果，選取0.5、1、2、5uM等4個濃

22、度作為后續(xù)實驗中BPS的處理濃度。
　　 2.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1蛋白表達的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細胞24h，48h后各組細胞TGFβ1蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24h: F=26.441，P＜0.001;48h: F=14.939，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細胞TGFβ1蛋白表達量均顯著增加(P＜0.001)。HG聯(lián)合不同濃度B

23、PS培養(yǎng)細胞24h后，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞TGFβ1蛋白表達量均顯著降低(P=0.001);HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞48h后，與HG組相比，各濃度BPS組細胞TGFβ1蛋白表達量呈濃度依賴性下降(P=0.011)。
　　 3.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞FN蛋白表達的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細胞24h，48h后各組細胞FN蛋白表達量

24、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24h: F=5.445，P=0.008;48h: F=10.736，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細胞FN蛋白表達量均顯著增加(P=0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞24h后，與HG組相比， HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞FN蛋白表達量均顯著降低（P值分別為0.018，0.007）;HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞48h后，與HG組相比，HG+1uM

25、BPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞FN蛋白表達量均顯著降低(P=0.005)。
　　 4.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MMP-2蛋白表達的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細胞24h，48h后各組細胞MMP-2蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24h: F=7.232，P=0.002;48h: F=4.610，P=0.014）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)HBZY-1細胞24h及48h后，細胞

26、MMP-2蛋白表達量均顯著下降(P=0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞24h后，與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞MMP-2蛋白表達量顯著增加（P值分別為0.017，0.001）;HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞48h后，與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞MMP-2蛋白表達量顯著增加（P值分別為0.019，0.007）。
　　 5.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1

27、細胞TGFβ1mRNA表達的影響:
　　 與NG組相比，HG組細胞TGFβ1 mRNA相對表達量明顯增加（2.45±0.22 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[1.92，2.99]）。與HG組相比，HG+0.5uMBPS組、HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞TGFβ1 mRNA表達水平逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（仁0.008）。
　　 6.不同濃度BPS對高糖環(huán)境

28、下HBZY-1細胞FN mRNA表達的影響:
　　 與NG組相比，HG組細胞FN mRNA表達相對量明顯增加（1.93±0.23 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[1.36，2.51]）。與HG組相比，HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞FN mRNA相對表達量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.006，＜0.001）。
　　 7.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MMP-

29、2 mRNA表達的影響:
　　 與NG組相比，HG組細胞MMP-2 mRNA表達相對量顯著下降（0.528±0.132vs.1.000±0.000，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[0.199，0.857]）。與HG組相比，HG聯(lián)合不同濃度BPS組細胞MMP-2 mRNA相對表達量有上升趨勢。但統(tǒng)計學(xué)分析提示，HG組與HG聯(lián)合不同BPS濃度組，各組細胞MMP-2mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.906，P=0.497)，可

30、能與樣本量偏小，或檢測MMP-2 mRNA時間點的選擇有關(guān)。
　　 8.不同時間點高糖誘導(dǎo)HBZY-1細胞p38 MAPK磷酸化蛋白的表達:
　　 HG0min組細胞有少量磷酸化p38 MAPK蛋白表達，HG刺激15min后細胞p38MAPK磷酸化蛋白表達最明顯，刺激30min后p38MAPK磷酸化蛋白的表達開始減弱，刺激90min磷酸化p38MAPK蛋白信號仍未消失。
　　 9.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZ

31、Y-1細胞p38 MAPK蛋白磷酸化的影響:
　　 不同處理組刺激細胞15min后，HG組HBZY-1細胞p38 MAPK磷酸化蛋白表達與NG組相比明顯增多(P＜0.001);與HG組比較，HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細胞，隨著BPS藥物濃度的增加，細胞p38 MAPK磷酸化蛋白表達逐漸減少(P=0.006)。
　　 10.不同時間點高糖誘導(dǎo)HBZY-1細胞ERK磷酸化蛋白的表達:
　　 HG0min細胞有少量磷

32、酸化ERK蛋白表達，HG刺激15min后細胞ERK磷酸化蛋白表達明顯增多，刺激30min后ERK磷酸化蛋白的表達開始減弱，刺激至90min磷酸化p38MAPK蛋白條帶仍未消失。
　　 11.不同濃度BPS對高糖環(huán)境中HBZY-1細胞ERK蛋白磷酸化的影響:
　　 HG刺激15 min后，HG組HBZY-1細胞ERK磷酸化蛋白表達比NG組明顯增多(P＜0.001);與HG組比較，HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細胞，隨著BPS

33、藥物濃度的增加，細胞ERK磷酸化蛋白表達水平逐漸減少(P＜0.001)。
　　 12.不同時間點高糖誘導(dǎo)HBZY-1細胞Smad3蛋白磷酸化的表達:
　　 HG0min及HG15min組未能檢測到細胞Smad3磷酸化蛋白的表達;HG30min組Smad3磷酸化蛋白開始表達，HG刺激60min時Smad3磷酸化蛋白表達最明顯，刺激90min時明顯減弱。
　　 13.不同濃度BPS對高糖環(huán)境中HBZY-1細胞Smad

34、3蛋白磷酸化的影響
　　 HG刺激60min后，HG組HBZY-1細胞Smad3磷酸化蛋白與NG組比較表達增多(P=0.007);與HG組相比，HG+2uMBPS組與HG+5uMBPS組細胞Smad3磷酸化蛋白表達水平明顯下降（P值分別為0.012，0.004）。
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞的增殖;
　　 2.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1、FN蛋

35、白質(zhì)的合成及mRNA的表達，并增加了HBZY-1細胞MMP-2蛋白質(zhì)的合成;
　　 3.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞p38 MAPK、ERK磷酸化蛋白表達與Smad3蛋白的磷酸化。BPS可能通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的相互作用，對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞ECM合成與代謝過程進行保護性的調(diào)控。
　　 第二章貝前列素鈉對高糖環(huán)境下大鼠系膜細胞MCP-1表達的影響
　　 目的:
　　 1.觀察不同濃度

36、BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1蛋白質(zhì)表達的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1 mRNA表達的影響。
　　 3.探討NFκB信號通路是否參與了BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1表達的調(diào)控。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)同第一章
　　 2.細胞處理分組:
　　 NG組，HG組，HG聯(lián)合不同濃度BPS(0.5uM，1uM，2uM

37、與5uM)組，增加HG+PDTC(1uM)組。
　　 3.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h，48h收集細胞培養(yǎng)上清液，用Elisa法測定細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1蛋白質(zhì)的表達量。
　　 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h收集細胞，用實時熒光定量(real-time) PCR法測定細胞MCP-1 mRNA的相對表達量(2-△△Ct)。
　　 5.用免疫印跡法分別檢測0min，15min，3

38、0min，60min，90min不同時間點HG培養(yǎng)條件下HBZY-1細胞NFκ B p65亞基核轉(zhuǎn)位的情況。
　　 6.選取HG誘導(dǎo)HBZY-1細胞NFκB p65亞基核轉(zhuǎn)位最顯著的時間點，應(yīng)用免疫印跡法檢測改時間點HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)HBZY-1細胞NFκBp65亞基核轉(zhuǎn)位的變化情況。
　　 7.用細胞免疫熒光染色法觀察不同處理組NFκB p65亞基核轉(zhuǎn)位的變化。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)處理:同第一章。

39、　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1蛋白表達的影響:
　　 不同處理組分別培養(yǎng)細胞24h，48h后各組細胞MCP-1蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24h: F=6.973，P=0.001;48h: F=10.436，P＜0.001）。與NG組相比，HG組分別培養(yǎng)24h及48h后HBZY-1細胞MCP-1蛋白表達量均顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+PDTC組分別培養(yǎng)細

40、胞24h、48h后，細胞MCP-1蛋白表達量均顯著下降(P＜0.001)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞24h后，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞MCP-1蛋白表達量顯著降低(P=0.006); HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞48h后，與HG組相比， HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組及HG+5uMBPS組細胞MCP-1蛋白表達量顯著降低(P=0.003)。
　　 2.不

41、同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1 mRNA表達的影響:
　　 與NG組相比，HG組細胞MCP-1 mRNA表達相對量明顯增加（4.62±0.12 vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[4.32，4.93]）。與HG組相比，HG+PDTC組細胞MCP-1 mRNA相對表達量顯著下降(P＜0.001);HG聯(lián)合不同濃度BPS組細胞MCP-1 mRNA相對表達量較HG組均顯著下降(P=0.011)。

42、
　　 3.不同時間點高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的變化
　　 HG0min組細胞核內(nèi)檢測到少量NFκB p65蛋白的表達， HG刺激5min后即可檢測到核內(nèi)NFκB p65蛋白表達的增加;隨著刺激時間的延長，核內(nèi)NFκBp65蛋白的表達量逐漸增加，于刺激90min時最為明顯，刺激120min時開始減弱。
　　 胞漿內(nèi)NFκB p65蛋白在HG0min表達最明顯，HG刺激5min后胞漿內(nèi)NFκ

43、B p65蛋白表達量開始減少;隨著刺激時間的延長，胞漿內(nèi)NFκB p65蛋白的表達逐漸減少，至90min時表達量最少。
　　 4.免疫印跡法檢測不同濃度BPS對高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　 HG刺激90min后，HG組HBZY-1細胞核內(nèi)NFκB p65蛋白表達與NG組比較明顯增多。HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細胞，與HG組相比，HG+1uMBPS組、HG+2uMBPS組與HG+5uMBP

44、S組胞核NFκB p65蛋白表達逐漸減少(P=0.001)。
　　 HG刺激90min后，HG組HBZY-1細胞胞漿NFκB p65蛋白表達較NG組減少。HG聯(lián)合不同濃度的BPS培養(yǎng)細胞，與HG組相比，HG+2uMBPS組與HG+5uMBPS組胞漿NFκB p65蛋白表達逐漸增多（P分別為0.049，0.034）。
　　 5.細胞免疫熒光法觀察BPS對高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細胞NFκB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　

45、各不同處理組培養(yǎng)細胞90min后，NG組NFκB p65紅色熒光均顯示于胞漿中，胞核中未見NFB p65紅色熒光。HG組NFκB p65紅色熒光集中于胞核中，胞漿中僅有少量NFκB p65紅色熒光。用PDTC預(yù)先處理細胞1h抑制NFκB的活化，HG+PDTC組細胞NFκB p65紅色熒光在胞核中的表達明顯減少。與HG組比較，HG+2uMBPS組NFκB p65紅色熒光在核內(nèi)顯示明顯減少，在胞漿內(nèi)顯示明顯增多，與HG+PDTC組結(jié)果相似。

46、
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1蛋白質(zhì)的合成及mRNA的表達;
　　 2.BPS能夠抑制高糖環(huán)境下HBZY-1細胞NFκB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，從而抑制了高糖誘導(dǎo)的NFκB的激活，可能參與了BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1表達的調(diào)控。
　　 第三章PPARβ/δ在貝前列素鈉減輕高糖對系膜細胞損傷中的作用
　　 目的:
　　 1.觀察不

47、同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞PPARβ/δ蛋白表達的影響。
　　 2.觀察不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞PPARβ/δ mRNA表達的影響。
　　 3.觀察選擇性PPARβ/δ受體拮抗劑GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1、FN與MMP-2合成的影響。
　　 4.觀察GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MAPK信號通路的影響。
　　 5.觀察GSK0660對高

48、糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1表達的影響。
　　 6.觀察GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞NFκB-DNA結(jié)合活性的影響。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)同第一、二章。
　　 2.細胞處理分組:
　　 NG組，HG組，HG+2uMBPS組，HG+GSK0660(5uM)組，HG+2uMBPS+GSK0660(5uM)組，HG+PDTC(1uM)組。
　　 3.不同處理組體外

49、培養(yǎng)HBZY-1細胞，于24h收集細胞，用免疫印跡法檢測細胞PPAβ/δ蛋白質(zhì)的表達量。
　　 4.不同處理組體外培養(yǎng)HBZY-1細胞，于12h收集細胞，用實時熒光定量(real-time) PCR法測定細胞PPARβ/δ mRNA的相對表達量（2以△Ct）。
　　 5.正式刺激前，提前用GSK0660預(yù)處理細胞1h拮抗PPARβ/δ受體的作用，然后按上述處理分組繼續(xù)培養(yǎng)細胞24h。
　　 6.收集細胞培養(yǎng)上清液

50、用Elisa法測TGFβ1、FN及MMP-2的蛋白質(zhì)表達。
　　 7.HBZY-1細胞p38 MAPK、Erk1/2磷酸化蛋白表達測定同第一章。
　　 8.收集細胞培養(yǎng)上清液用Elisa法測MCP-1的蛋白質(zhì)表達量。
　　 9.應(yīng)用EMSA法檢測NFκB p65-DNA結(jié)合活性變化。
　　 10.統(tǒng)計學(xué)處理:同第一、二章。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞

51、PPARβ/δ蛋白表達的影響
　　 NG組HBZY-1細胞核內(nèi)存在PPARβ/δ蛋白的表達。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后胞核PPARβ/δ蛋白表達量減少(P=0.028)。HG聯(lián)合不同濃度BPS培養(yǎng)細胞24h后，各組胞核PPARβ/δ蛋白表達量均較HG組增加(P=0.009)。在不同濃度BPS組中，HG+2uMBPS組PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表達相對量升高最明顯(P＜0.001 vs.HG+0.5uMBPS);HG

52、+5uMBPS組PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表達相對量較HG+2uMBPS組下降(P=0.017 vs.HG+2uMBPS)。
　　 2.不同濃度BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞PPARβ/δ mRNA表達的影響:
　　 與NG組相比，HG組細胞PPARβ/δ mRNA表達相對量明顯下降（0.69±0.02vs.1.00±0.00，HG組均數(shù)的95％置信區(qū)間為[0.64，0.73]）。與HG組相比，HG聯(lián)合不同

53、濃度BPS組細胞PPARβ/δ mRNA相對表達量均顯著上升(P＜0.001)。在不同濃度BPS組中，HG+2uMBPS組PPARβ/δ mRNA表達相對量升高最明顯(P＜0.001 vs.HG+0.5uMBPS); HG+5uMBPS組PPARβ/δ mRNA表達相對量較HG+2uMBPS組下降(P＜0.001 vs.HG+2uMBPS)。
　　 3.GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1合成的影響:
　　

54、 不同處理組培養(yǎng)細胞24h后，各組細胞TGFβ1蛋白表達量有顯著差異(F=16.429，P＜0.001)。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后細胞TGFβ1蛋白表達量顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組培養(yǎng)24h后細胞TGFβ1蛋白表達量顯著下降(P=0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660組細胞TGFβ1蛋白表達量與HG+2uMBPS組比較顯著上升(P=0.049);而HG+GSK0660組與HG組比較，

55、兩組細胞TGFβ1蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.621)。
　　 4.GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞FN合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細胞24h后，各組細胞FN蛋白表達量有顯著差異（F=26.493，P＜0.001）。與NG組相比，HG培養(yǎng)24h后細胞FN蛋白表達量顯著增加（P＜0.001）;與HG組比較，HG+2uMBPS組培養(yǎng)24h后細胞FN蛋白表達量顯著下降(P=0.001)。HG+2uMBP

56、S+GSK0660組細胞FN蛋白表達量與HG+2uMBPS組相比顯著上升(P=0.047);而HG+GSK0660組與HG組比較，兩組FN蛋白表達量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.592)。
　　 5.GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MMP-2合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細胞24h后，各組細胞MMP-2蛋白表達量有顯著差異（F=10.269，P=0.001）。與NG組相比，HG組細胞MMP-2蛋白表

57、達量顯著下降(P＜0.001);與HG組比較，HG+2uMBPS組細胞MMP-2蛋白表達量顯著上升，(P=0.017)。HG+2uMBPS+GSK0660組細胞MMP-2蛋白表達量與HG+2uMBPS組比較變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.956); HG+GSK0660組與HG組比較，兩組細胞MMP-2蛋白表達量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.958)。
　　 6.GSK0660對HG高糖環(huán)境下HBZY-1細胞p38

58、 MAPK信號通路的影響:
　　 HG刺激15min后，與NG組比較，細胞內(nèi)p38磷酸化蛋白表達顯著增加(P＜0.001)。HG+2uMBPS組與HG組比較，細胞內(nèi)磷酸化p38蛋白表達減少(P＜0.001)。與HG+2uMBPS組比較，HG+2uMBPS+GSK0660組細胞內(nèi)磷酸化p38蛋白表達明顯增加(P＜0.001)。HG+GSK0660組與HG組比較，細胞磷酸化p38蛋白表達變化不明顯(P=0.061)。
　　

59、7.GSK0660對HG高糖環(huán)境下HBZY-1細胞ERK信號通路的影響:
　　 HG刺激15min后細胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達較NG組顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組細胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達明顯下降(P＜0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660組細胞內(nèi)ERK磷酸化蛋白表達較HG+2uMBPS組有所增加(P＜0.001)。HG+GSK0660組與HG組比較，細胞內(nèi)磷酸化ERK蛋白表達水平無明

60、顯變化(P=0.093)。
　　 8.GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1合成的影響:
　　 不同處理組培養(yǎng)細胞24h后，各組細胞MCP-1蛋白表達量有顯著差異(F=11.402，P=0.001)。與NG組相比，HG組細胞MCP-1蛋白表達量顯著增加(P＜0.001)。與HG組比較，HG+2uMBPS組細胞MCP-1蛋白表達量顯著下降(P=0.004)。HG+2uMBPS+GSK0660組MCP-1蛋白表

61、達量與HG+2uMBPS組相比顯著上升(P=0.042);而HG+GSK0660組與HG組比較，兩組MCP-1蛋白表達量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.847)。
　　 9.GSK0660對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞NFκB p65-DNA結(jié)合活性的影響:
　　 NG組未見NFκB-DNA的結(jié)合條帶，HG組可見明顯的NFκB-DNA結(jié)合條帶，說明HG導(dǎo)致NFκB的激活，并且促進了NFκB與DNA的結(jié)合。用PDTC預(yù)

62、處理細胞后，HG+PDTC組NFκB-DNA結(jié)合條帶比HG組明顯減弱，HG+GSK0660組NFκB-DNA結(jié)合條帶與HG組比較變化不明顯，提示GSK0660拮抗RRARβ/δ受體的作用后對HG導(dǎo)致的NFκB的激活沒有影響。
　　 HG+2uMBPS組的NFκ B-DNA結(jié)合條帶比HG組明顯減弱，與HG+PDTC組的結(jié)果相似，說明2uM BPS能夠抑制HG誘導(dǎo)的NFκB與DNA的結(jié)合。HG+2uMBPS+GSK0660組的NFκ

63、B-DNA結(jié)合條帶比HG+2uMBPS組有所增強，提示BPS能夠通過與RRARβ/δ受體作用，抑制HG誘導(dǎo)的NFκB與DNA的結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 1.BPS能夠上調(diào)高糖環(huán)境下HBZY-1細胞PPARβ/δ蛋白與mRNA的表達;
　　 2.GSK0660能夠逆轉(zhuǎn)BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1、FN合成的抑制作用;而對BPS增加細胞MMP-2的合成沒有影響，提示BPS能夠通過與PPARβ/δ受體

64、結(jié)合，調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下HBZY-1細胞TGFβ1、FN的合成;而BPS對細胞MMP-2的合成調(diào)節(jié)作用可能不通過PPARβ/δ受體途徑;
　　 3.GSK0660能夠拮抗BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞內(nèi)p38 MAPK、ERK蛋白磷酸化的抑制作用;提示BPS可以通過與PPARβ/δ受體結(jié)合，抑制HG誘導(dǎo)的p38 MAPK與ERK的激活;
　　 4.GSK0660能夠逆轉(zhuǎn)BPS對高糖環(huán)境下HBZY-1細胞MCP-1合成的抑