滋養(yǎng)層細(xì)胞促融合表位肽疫苗的體液免疫效應(yīng)及其抗生育潛能的研究.pdf

1、目的： 以人滋養(yǎng)層細(xì)胞促融合表位模擬肽(P<,09-04>)為基礎(chǔ)設(shè)計、合成多肽免疫原，免疫C57BL/6型小鼠，觀察體液免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，評價其免疫原性，探討如何將表位模擬肽構(gòu)建成有效的表位肽疫苗；通過分析表位多肽所誘導(dǎo)的抗血清與天然抗原的交叉反應(yīng)性，及其體外抑制人絨毛膜癌細(xì)胞(BeWo)融合的能力，評估其抗生育的潛能。 方法： 1．以人滋養(yǎng)層細(xì)胞促融合表位模擬肽與一種通用輔助T細(xì)胞表位(PADRE)作為骨架，設(shè)

2、計出八分枝多價抗原肽(PADRE-P<,09-04>)<,8>-MAP和線性嵌合肽(PADRE-P<,09-04>)兩種結(jié)構(gòu)免疫原。在固相自動肽合成儀上進(jìn)行合成，高效液相色譜儀上進(jìn)行純化及純度分析，純化后的多肽行質(zhì)譜鑒定。 2．純化后的MAP結(jié)構(gòu)肽(P1)、線性結(jié)構(gòu)肽(P2)和表位模擬肽(P3)，分別與等量弗氏佐劑混懸后皮下免疫雌性C57BL/6小鼠，采用第0、3、6周三次免疫程序，100μg/只，首次免疫后第2、5、8、10、

3、12周取樣，應(yīng)用ELISA間接法測定血清IgG及子宮粘膜沖洗液中l(wèi)eA抗體生成情況，比較不同合成肽的免疫原性。 3．取正常妊娠早期(6～8周)人工流產(chǎn)的新鮮絨毛組織，以效價較高的小鼠免疫血清為一抗，以未免疫的正常小鼠血清作為陰性對照，通過免疫組化法檢測免疫血清中特異性抗體識別人滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)抗原表位的能力。 4．應(yīng)用forskolin誘導(dǎo)的BeWo細(xì)胞融合來模擬體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化融合過程。首先通過MTT法檢測小鼠血清存在

4、下BeWo細(xì)胞增殖及活性情況，然后將細(xì)胞分為四組：Ⅰ組：應(yīng)用HAM's F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；Ⅱ組：含有100μM Forskolin的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；Ⅲ組：含100μM Forskolin、10％未免疫鼠血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；Ⅳ組：含100μMForskolin、10％鼠抗血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法分別標(biāo)記BeWo細(xì)胞膜與胞核，統(tǒng)計各組細(xì)胞的融合率，分析抗血清抑制BeWo細(xì)胞融合的能力。

5、結(jié)果 1．純化后的合成肽行HPLC均顯示為單峰，經(jīng)積分計算，純度均達(dá)到95％以上，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示分子量分別為23372、2826.3和1721.8，與理論分子量相吻合。 2．小鼠血清中抗表位模擬肽IgG抗體的檢測：合成肽P1組第5周出現(xiàn)陽性，抗體水平隨免疫次數(shù)和時間而升高，至第10周達(dá)到最高(1：1200)；合成多肽P2組第8周檢測到低水平的針對模擬表位的IgG抗體(1：200)，抗體水平隨時間變化不大；合成多肽P3在

6、在測定的時間未檢測到抗體的產(chǎn)生，與陰性對照組不具有顯著性差異。且五次血清抗體測量，都呈現(xiàn)出了各組多肽誘導(dǎo)抗體滴度的趨勢為：P1>P2>P3。 3．小鼠免疫后子宮粘膜沖洗液中抗表位模擬肽IgA抗體的檢測：合成肽P1組第8周檢測到了低水平的抗表位模擬肽IgA抗體，第10周達(dá)到最高，而合成肽P2與P3組在觀測時間內(nèi)未檢測出特異性抗體，并且與陰性對照組無顯著性差異。且五次子宮粘膜沖洗液的抗體測量，都呈現(xiàn)出了各組多肽誘導(dǎo)抗體滴度的趨勢為：

7、P1>P2/P3。 4．應(yīng)用P1組免疫血清作為一抗，經(jīng)免疫組化法顯示抗血清與早期人流產(chǎn)絨毛組織表面的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及內(nèi)側(cè)的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞呈現(xiàn)特異的結(jié)合，主要分布在細(xì)胞胞膜上和胞漿中，但與絨毛中其他組織細(xì)胞無反應(yīng)。未免疫鼠正常血清與人絨毛組織間無交叉反應(yīng)。 5．應(yīng)用MTT法檢測結(jié)果提示鼠血清對BeWo細(xì)胞的增值及活性無明顯影響，為下一步比較各組細(xì)胞融合率提供了前提條件。應(yīng)用BeWo細(xì)胞融合來模擬體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化融合的實(shí)驗

8、顯示：在forskolin誘導(dǎo)下，BeWo細(xì)胞間融合率由1.59％(Ⅰ組)升高到11.45％(Ⅱ組)，在10％抗血清存在下，細(xì)胞間融合率明顯下降至6.97％(Ⅳ組)，且Ⅱ組細(xì)胞融合率與Ⅳ組之間具有非常顯著性差異(P<0.01)，而含有10％未免疫鼠血清的Ⅲ組細(xì)胞融合率為11.1％，與Ⅱ組無明顯差異，但與Ⅳ組細(xì)胞融合率之間具有非常顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論 以人滋養(yǎng)層細(xì)胞促融合表位模擬肽與一種通用輔助T細(xì)胞表位(P