FSHR B細胞表位篩選及其多肽疫苗抗生育作用的研究.pdf

1、世界人口的持續(xù)快速增長，男性愿意共同承擔計劃生育的責任，因此開發(fā)新型的男性避孕方法是當務之急。避孕疫苗(contraceptive vaccine，CV)具有高效、安全、經(jīng)濟、可逆等優(yōu)點，是目前避孕研究中極具前景的研究熱點之一。避孕疫苗根據(jù)其作用的靶點不同，分為靶向配子的產(chǎn)生、配子的功能和配子的結局三類。男性避孕疫苗主要是通過干擾激素調控的精子發(fā)生、抑制精子活動力或是精卵相互作用過程中的任何一步達到抑制生育的作用。 卵泡刺激素(

2、follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)通過與其特異性表達于睪丸支持細胞(Sertoli cell，SC)的受體(FSHR)結合來啟動和維持男性的精子發(fā)生。因而FSHR可作為男性避孕疫苗的靶抗原之一。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR的胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)存在多個參與激素受體結合或信號傳導的不連續(xù)區(qū)域。既往的研究采用單抗或多抗探針、噬菌體展示技術、肽競爭結合或表位作圖的方法來篩選激素受體結

3、合的位點，但是篩選出的位點用于抗生育力研究的較少，或是抑制生育力效果欠佳。 附睪蛋白酶抑制劑(epididymis protease inhibitor，Eppin)表達于精子頂體后區(qū)、睪丸的支持細胞、間質細胞和圓形精子以及附睪上皮的主細胞，可能與精子的成熟密切相關。射精后覆蓋于精子表面的Eppin與精液凝固蛋白(semenogelin，Sg)飽和性結合，為精子提供抗菌作用。研究顯示重組Eppin蛋白免疫雄猴能顯著抑制雄猴的生育

4、力，停止免疫后71％雄猴能恢復生育力，因此Eppin是開發(fā)避孕疫苗的候選抗原。 因此本研究的目的在于篩選FSHR的優(yōu)勢中和性B細胞表位，觀察多肽疫苗抗生育的有效性和安全性。本研究將hFSHR ECD按蛋白質氨基酸序列分為1-140aa和120-350aa兩段，通過基因擴增和構建原核表達載體，從而誘導蛋白的表達并純化。通過ECD二級結構的分析、在線B細胞表位預測和分子對接技術最后選定了4個候選肽，聯(lián)合泛DR輔助T細胞表位(pan-

5、DR epitope，PADRE)合成融合肽段。采用蛋白初次免疫.候選肽強化免疫的策略免疫成年雄性B alb/C小鼠，觀察各表位肽激發(fā)抗體的產(chǎn)生及對小鼠生育力的影響。由于單一針對FSHR所獲得的避孕效應只能中等程度的抑制小鼠生育力，因此聯(lián)合Eppin免疫，以觀察多價疫苗對生育力的抑制效應。以重組蛋白疫苗為對照，分析表位肽疫苗的抗生育潛能和安全性。 方法： 1. hFSHR ECD和Eppin原核蛋白的誘導表達

6、hFSHR ECD的1-140aa段和120-350aa段基因分別采用橋連拼接PCR擴增，Eppin基因序列以人睪丸cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得。目的基因連入pET32a載體，ImMIPTG誘導原核蛋白表達，并對表達的蛋白進行純化和鑒定。純化后的重組hFSHR蛋白按所含的氨基酸分別記為F140和F240。 2.FSHR ECD B細胞表位的分析預測 采用DNAstar protein軟件，從二級結構、親水性、可及性、

7、可塑性和抗原指數(shù)等幾方面對FSHR ECD進行分析；利用B細胞表位在線預測，從親水性、可及性、轉角、極性和抗原性等參數(shù)對胞外區(qū)進行在線分析；以hFSH和FSHR相互作用復合體的晶體結構為初始模版(PDB ID:1xwd)，利用InsightⅡ分子模擬軟件包完成FSHR與FSH的分子對接。 3.FSHR B細胞表位融合肽的合成 為增強免疫原性，F(xiàn)SHR B細胞表位前接泛DR Th表位肽(PADRE)，融合肽送上海吉爾生化有

8、限公司合成。 4.B細胞表位肽疫苗的免疫效應 采用重組hFSHR蛋白質初次免疫、B細胞表位肽強化的免疫策略，與弗氏佐劑混合后免疫成年雄性B alb/C小鼠。初免后2周進行強化免疫，每周強化一次，共3次。采用ELISA法檢測動態(tài)監(jiān)測小鼠血清特異性IgG滴度變化。Westem blot法檢測小鼠血清與人睪丸蛋白的結合。在此基礎上，聯(lián)合Eppin優(yōu)勢B細胞表位免疫小鼠，ELISA法動態(tài)監(jiān)測小鼠血清特異性IgG滴度變化。

9、 5.B細胞表位肽疫苗對生育力的抑制作用 末次免疫結束后2周和6周，分別將雄鼠與健康有生育力的雌鼠按1：3混合喂養(yǎng)2周，觀察雌鼠受孕率和每胎產(chǎn)仔數(shù)。 6.免疫小鼠的生殖內分泌改變及機制研究 末次合籠實驗結束后2周，隨機處死小鼠，采集小鼠血清、睪丸、附睪。從精子計數(shù)、精子活力和精子尾部低滲膨脹實驗(HOS)等方面對附睪精子進行分析：從睪丸重量和睪丸精子2方面對睪丸進行觀察；放免法測定小鼠血清睪酮(T)水平；聯(lián)合Ep

10、pin免疫組還觀察小鼠血清對正常人精子的抑制作用和檢測小鼠附睪沖洗液中IgA滴度。 7.免疫小鼠睪丸組織學檢查 處死小鼠分離睪丸組織固定，切片后行HE染色，觀察睪丸的組織學改變。 8.生育力恢復實驗 小鼠初次免疫后40周(末次接種后36周)，ELISA檢測血清特異性抗體滴度降至1：5000以下，雄鼠與雌鼠按1：3混合喂養(yǎng)2周，觀察雌鼠受孕率和每胎產(chǎn)仔數(shù)。 結論： 1、通過PCR獲得了hFS

11、HR ECD和hEppin的DNA序列，成功地構建了含有目的基因的原核表達載體并誘導蛋白表達。經(jīng)純化和復性后，重組蛋白的純度大于95010，具有較好的生物學特性。 2、利用DNAstar對hFSHR ECD二級結構進行分析，預測潛在的B細胞表位，結合B細胞表位在線預測和分子對接技術以提高預測的準確性，綜合分析結果，最后選擇了4個候選B細胞表位肽。 3、為了增強B細胞表位肽的免疫原性，聯(lián)合候選肽與PADRE合成融合肽，合成

12、的肽純度均>85％。 4、采用FSHR蛋白初免、B細胞表位肽強化免疫的策略能有效誘導機體產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。FSHR的B細胞表位肽疫苗能通過減少精子數(shù)量而降低小鼠的生育力，但是伴有睪丸縮小、血睪酮降低和睪丸組織學改變的副作用； 5、聯(lián)合Eppin與FSHR免疫，在精子數(shù)量減少的同時，精子活力下降，導致小鼠的生育力進一步下降，但是的副反應并沒有進一步加重。以后還需在疫苗劑型上深入研究以增強表位肽的免疫原性而降低甚至避免