附睪蛋白酶抑制蛋白的B細(xì)胞表位分析及抗生育效應(yīng)研究.pdf

1、世界人口持續(xù)增長(zhǎng)的壓力和非計(jì)劃妊娠對(duì)生殖健康的危害使人們深刻認(rèn)識(shí)到進(jìn)一步完善避孕措施的迫切性。目前針對(duì)男性的避孕措施僅限于安全套和輸精管結(jié)扎，前者不夠方便，后者不可逆，因而遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。開(kāi)發(fā)更方便、高效、安全、可逆的男性避孕方法成為計(jì)劃生育研究的重要課題。迄今，男性避孕疫苗候選分子很多，但尚面臨避孕效果不理想以及T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷等局限。針對(duì)這兩個(gè)局限，設(shè)計(jì)新的疫苗形式和免疫策略實(shí)現(xiàn)突破，對(duì)開(kāi)發(fā)安全、有效的避孕疫苗具有重要意義。

2、 附睪蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor，Eppin)基因的發(fā)現(xiàn)為男性避孕疫苗的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了曙光。Eppin蛋白特異表達(dá)于睪丸和附睪，在精子成熟中具有重要作用。抗Eppin抗體可直接破壞Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin，Sg)復(fù)合體，干擾Eppin調(diào)控前列腺特異性抗原對(duì)Sg的水解作用，影響精子活動(dòng)力，進(jìn)而抑制生育力。利用重組Eppin蛋白免疫雄猴獲得了較理想的避孕效果(78％)

3、，停止免疫后，71％的受試雄猴恢復(fù)了生育力。由此可見(jiàn)，Eppin可望作為男性避孕的有效靶點(diǎn)，但仍需針對(duì)男性避孕疫苗存在的上述局限尋求突破。篩選獲得Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位，并通過(guò)免疫小鼠研究其抗生育有效性和安全性是本研究的目的。 出于安全考慮，全長(zhǎng)蛋白不適于用作疫苗，找出真正抑制生育的關(guān)鍵性表位并增強(qiáng)其免疫原性和避孕效果是關(guān)鍵?；诿庖邔W(xué)基本理論，我們?cè)O(shè)想，用全長(zhǎng)Eppin蛋白免疫，將會(huì)產(chǎn)生針對(duì)其各個(gè)表位的記憶細(xì)胞克隆，當(dāng)只

4、用某個(gè)表位肽再次免疫時(shí)，則只有針對(duì)該表位的記憶細(xì)胞被激活、增殖進(jìn)而分泌抗體。如果初次免疫采用重組人Eppin蛋白(recombinant human Eppin，thEppin)，加強(qiáng)免疫分別采用各候選表位肽，則可以通過(guò)所產(chǎn)生的抗體滴度高低來(lái)判斷該表位是否優(yōu)勢(shì)表位；而通過(guò)分析被免疫小鼠的生育力抑制效果及其抗血清對(duì)精子活力的體外抑制能力，則可判斷該表位是否中和性表位。因此，我們擬采用該策略來(lái)篩選Eppin的優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位并研究其抗生育

5、潛能。 本研究首先通過(guò)RT-PCR法從人新鮮睪丸組織擴(kuò)增獲得Eppin cDNA，構(gòu)建入原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)純化獲得重組人Eppin蛋白(第一部分)。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析Eppin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面特性，預(yù)測(cè)出Eppin蛋白的B細(xì)胞表位所在區(qū)域；并通過(guò)與抗血清的結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，得出Eppin候選優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位區(qū)段(第二部分)。最后，采用thEppin初次免疫，上述候選表位肽加強(qiáng)免疫的策略，觀察各個(gè)表位肽刺激抗體產(chǎn)

6、生、抗體對(duì)精子活力的抑制能力，以此進(jìn)一步篩選出其優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位，并以thEppin重復(fù)免疫為對(duì)照，分析其抗生育潛能及安全性(第三部分)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①通過(guò)分析Eppin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面特性(包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親水性、可塑性、溶劑可及性及免疫原性等)，初步預(yù)測(cè)出Eppin蛋白的B細(xì)胞表位區(qū)域在第19～31、30～44、58～70、73～85、94～102、103～115、113～124、125～132區(qū)段：與抗血清的結(jié)合

7、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第58～70、19～31、103～115、113～124區(qū)域的抗原性相對(duì)較強(qiáng)，從而初步篩選得出了Eppin候選優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位(前述四個(gè)肽分別命名為肽A～D)。②進(jìn)一步采用thEppin初次免疫-候選表位肽加強(qiáng)免疫的篩選策略，發(fā)現(xiàn)用四個(gè)候選表位肽加強(qiáng)免疫時(shí)都能激發(fā)產(chǎn)生高滴度的抗體，并維持至8～9個(gè)月，而僅B肽、C肽和D肽加強(qiáng)免疫時(shí)所獲得的抗血清能與人精子天然Eppin蛋白結(jié)合，其中僅C肽加強(qiáng)免疫獲得的抗血清能顯著抑制人精子活力。從

8、而獲知Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位所在區(qū)段為Eppir1103-115。③接受thEppin初次免疫—表位肽C加強(qiáng)免疫的雄鼠(EC組)，只能使26,6％的雌鼠受孕，與PBS組(88.9％)相比顯著降低，說(shuō)明雄鼠的生育力受到抑制；而免疫8～9個(gè)月后，伴隨抗體滴度下降，該組雄鼠能使雌鼠的受孕率達(dá)80％，與PBS組(87％)無(wú)顯著差別，說(shuō)明避孕作用具有可逆性。④接受thEppin重復(fù)免疫的雄鼠(Eppin組)，產(chǎn)生的抗體滴度雖略高于EC組，而

9、抗生育效果兩組相當(dāng)。Eppin組和EC組都只是顯著抑制了附睪精子的活力，而性激素水平、精子生成等均未受影響。各組織器官的病理檢查也未發(fā)現(xiàn)異常。但理論上，采用thEppin初次免疫—候選表位肽加強(qiáng)免疫策略，產(chǎn)生的抗體更多針對(duì)該表位肽，從而更具有安全性。 本研究結(jié)果表明計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)結(jié)合蛋白初免一表位肽加強(qiáng)免疫策略是篩選蛋白優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位的有效方法和又一選擇；Eppin蛋白的第103-115區(qū)段是Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位所在