HBeAg影響人胎盤滋養(yǎng)層細胞TLR3-4表達效應及其在母嬰傳播中作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種肝向性DNA病毒,嚴重威脅人類的健康。孕婦感染HBV后,可能經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒,引起宮內(nèi)感染,是我國人群HBV傳播的重要途徑。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是HBV的一種輔助蛋白,并不參與病毒的復制和組裝。HBeAg陽性慢性乙型肝炎(CHB)孕婦常持續(xù)感染HBV,并導致宮內(nèi)感染。研究發(fā)現(xiàn),HBeAg能抑制CHB患者的肝細胞、外周血單核細胞

2、和Kupffer細胞Toll樣受體2(TLR2)表達及其介導的天然免疫反應,相似的是,在HBeAg陽性CHB患者的外周血樹突狀細胞Toll樣受體3(TLR3)表達減少。此提示,HBeAg在病毒感染過程中可能起免疫調(diào)節(jié)作用,促進病毒持續(xù)感染。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的模式識別受體,可識別和應答病原體相關分子模式(PAMPs),在抵御各種病原微生物的免疫應答中發(fā)揮重

3、要作用。天然免疫系統(tǒng)是機體抗病原體感染的第一道防線,TLRs家族是其中重要的組成部分。
　　 TLRs可廣泛表達于哺乳動物的組織和細胞中。至今,已發(fā)現(xiàn)和鑒別了10種人屬TLRs,在人胎盤組織均可表達,TLR3、TLR4主要表達于胎盤滋養(yǎng)層細胞。TLRs信號傳導包括2條途徑:MyD88依賴性和非依賴性途徑,TLR3信號傳導主要通過MyD88非依賴的TRIF途徑,而TLR4主要通過MyDS8依賴性或非依賴性途徑傳導信號。TZR3、T

4、LR4可介導抑制肝臟細胞、外周血樹突狀細胞中HBV復制。TLR3可識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)并發(fā)生免疫應答,滋養(yǎng)層細胞在TLR3的配體多聚肌胞(polyI:C)處理后可產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(IFN-α/β),而IFN-β是由TLR3誘導細胞產(chǎn)生的主要細胞因子；以TLR4的配體脂多糖(LPS)刺激絨毛滋養(yǎng)層細胞可產(chǎn)生前炎癥細胞因子(如TNF-α)和趨化因子(如IL-8)。此提示,胎盤滋養(yǎng)層細胞可能通過TLR3、TLR4識別病毒相關分子模式

5、并觸發(fā)抗病毒反應。
　　 胎盤作為一種特殊的物理和免疫屏障,在防御不同微生物的侵襲中起重要作用。胎盤屏障的第一層細胞是滋養(yǎng)層細胞,該層細胞直接與母親血液接觸,可識別病原微生物并對其作出相應的免疫應答。因此,滋養(yǎng)層細胞在防御HBV宮內(nèi)感染中可能發(fā)揮重要的作用。
　　 但是,關于HBeAg陽性CHB孕婦持續(xù)感染HBV并導致宮內(nèi)感染的機制尚不清楚。Bewo細胞是一種人胎盤絨毛癌細胞系,現(xiàn)已被廣泛用于滋養(yǎng)層細胞功能的研究。本研究

6、擬分別構建1.3倍HBV基因組及HBeAg的真核表達載體,轉(zhuǎn)染Bewo細胞,建立HBV和HBeAg表達的細胞模型,并以此研究HBeAg對人胎盤滋養(yǎng)層細胞TLR3/4的表達及其生物效應的影響,探討胎盤HBV持續(xù)感染并垂直傳播給胎兒的機制,為防治HBV宮內(nèi)感染提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　 方 法
　　 1.HBeAg陽性慢性乙型肝炎孕婦胎盤組織TLR3、TLR4的表達及意義:選取22例HBeAg陽性和24例HBeAg陰性C

7、HB孕婦,及正常孕婦25例。建立實時熒光定量RT-PCR檢測胎盤組織中TLR3、TLR4 mRNA水平,同時以免疫組化法檢測其在胎盤組織中的表達,并采用熒光定量PCR(FQ-PCR)和微粒子酶免疫分析法(MEIA)分別定量檢測其血清HBV DNA和HBeAg水平。
　　 2.TLR3、TLR4介導的天然免疫對Bewo細胞中HBV復制的作用:以質(zhì)粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列為模板,構建1.3倍HBV全基因序列基因,

8、將其插入到真核表達載體peDNA3.1(+),用酶切、PCR及測序鑒定,并把該載體轉(zhuǎn)染Bewo細胞,以Western免疫印跡、MEIA和FQ-PCR分別檢測胞內(nèi)和上清中HBsAg、HBeAg的表達及HBV DNA水平。以RT-PCR和ELISA分別檢測細胞TRIF、MyD88 mRNA表達及其上清IFN-β、IFN-α水平。
　　 3.HBeAg對Bewo細胞TLR3、TLR4表達及其生物效應的影響:用PCR方法從質(zhì)粒pMD18

9、T-HBV中擴增HBeAg基因,克隆到peDNA3.1(+),構建真核表達載體peDNA3.1(+)-HBe,通過酶切、PCR及測序鑒定,并把該載體轉(zhuǎn)染Bewo細胞,用Western免疫印跡和MEIA檢測胞內(nèi)和上清中HBeAg的表達。以FQ-PCR和ELISA分別檢測細胞TLR3、TLR4 mRNA表達及細胞上清IFN-β、IFN-α水平,并采用免疫熒光染色法檢測細胞NF-κBp65核轉(zhuǎn)運。
　　 結(jié) 論
　　 1.HB

10、eAg陽性CHB孕婦血清HBeAg持續(xù)高表達,且其宮內(nèi)感染率顯著高于正常及HBeAg陰性孕婦,但胎盤組織TLR3、TLR4的mRNA、蛋白水平表達均顯著低于其余兩組；胎盤組織中TLR3、TLR4 mRNA表達與HBeAg水平呈負相關。此提示,HBeAg陽性CHB孕婦宮內(nèi)感染HBV與TLR3、TLR4低表達關系密切,其對胎盤TLR3、TLR4表達可能起負調(diào)節(jié)作用。
　　 2.成功構建了1.3倍HBV全基因真核表達載體pcDNA3.

11、1(+)-HBV1.3,為研究HBV宮內(nèi)感染的機制奠定了基礎。通過誘導Bewo細胞產(chǎn)生IFN-β和TNF-α,TLR3、TLR4介導的天然免疫應答可抑制HBV復制,但隨著HBV感染量的增大,其對HBV復制的抑制作用顯著下降。TLR3介導抑制Bewo細胞中HBV復制主要呈TRIF依賴性,而TLR4主要依賴于調(diào)節(jié)蛋白MyD88。此提示,激活TLR3、TLR4可能成為一種新穎和有效防治HBV宮內(nèi)感染的方法。
　　 3.成功構建了HBe

12、Ag真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBe,為研究內(nèi)源性HaeAg對Bewo細胞TLRs表達的作用奠定了基礎。polyI:C和LPS可顯著誘導Bewo細胞TLR3、TLR4 mRNA表達,且可通過IFN-β自分泌反饋誘導TLR3表達。HBeAg通過下調(diào)細胞TLR3、TLR4 mRNA的表達,抑制NF-κB激活和細胞因子產(chǎn)生,從而干擾Bewo細胞的免疫功能。此提示,HBeAg下調(diào)胎盤滋養(yǎng)層細胞TLR3和TLR4表達效應可能是引起HBV

13、宮內(nèi)感染的一個重要的因為。
　　 主要創(chuàng)新點
　　 1.成功構建了1.3倍HBV全基因真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBV1.3,建立了新型的滋養(yǎng)層細胞HBV表達模型,為研究HBV宮內(nèi)感染奠定了基礎。
　　 2.成功構建了HBeAg真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBe,建立了滋養(yǎng)層細胞HBeAg表達模型,為研究胞內(nèi)HBeAg對滋養(yǎng)層細胞TLRs表達及其生物效應的影響提供了一個良好的平臺。