硫氧還蛋白結合蛋白2-維生素D上調蛋白1（VDUP1）在哮喘患者外周血嗜酸細胞的表達和功能研究.pdf

1、研究背景 支氣管哮喘是常見的慢性疾病，研究哮喘的分子病理機制是有效控制哮喘的前提。針對哮喘的遺傳學基礎、與環(huán)境因素的關系、免疫機制等研究證實哮喘是受遺傳和環(huán)境因素影響的復雜的多基因疾病。同時也發(fā)現(xiàn)很多尚不明了和有爭議的問題，其中關于嗜酸性粒細胞(EOS)的作用是最大的爭論焦點之一。 EOS是參與哮喘病理過程的炎癥細胞之一。目前已經證明哮喘中EOS作用過程如下：抗原遞呈細胞將抗原遞呈到細胞表面，導致Th2細胞分化并產生Th

2、2細胞因子，其中IL-5、IL-13、GM-CSF促進骨髓CD34+干細胞向EOS方向分化，在IL-5誘導下，細胞從骨髓向血管遷移；IL-4、IL-13誘導血管細胞粘附分子(VCAM-1)表達，結合到其在EOS表面受體(VLA-4)，使得血管內EOS利于穿過血管壁，到達Th2細胞介導的炎癥反應部位；活化的EOS作用于氣道壁多種細胞，或者分泌Th2細胞因子，導致氣道粘膜以EOS浸潤為特征的炎癥、粘液分泌增加、氣道高反應性、基底膜膠原沉積等

3、哮喘病理生理過程。 而哮喘中EOS在活化、發(fā)揮炎癥效應過程中細胞內部信號轉導調節(jié)、分子調控機制以及這些細胞內部分子調控與細胞活化、發(fā)揮其在哮喘中病理作用的關系有待進一步探討。我們實驗室從哮喘發(fā)作過程中EOS基因差異表達入手，希望發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)作過程中EOS某些有意義的表達變化的基因，以及這些基因表達變化可能調控哪些EOS功能。因此，在早期研究中，應用抑制消減雜交技術，構建哮喘外周血EOScDNA消減文庫，并從中篩選出56個差異表達基

4、因，包括維生素D3上調蛋白-1/硫氧還蛋白結合蛋白2(VDUP1)。 氧化應激參與哮喘病理過程，哮喘中活化的炎癥細胞和免疫細胞產生活性氧自由基(ROS)增加，TRX作為強力抗氧化劑參與哮喘病理過程：已經證明，給予卵清蛋白致敏的哮喘發(fā)作小鼠TRX，能夠減輕氣道高反應性(AHR)以及氣道炎癥；急性加重哮喘病人血清TRX水平顯著增高，并與肺功能損傷程度呈正相關性；TRX作為包括肺損傷、哮喘等疾病治療靶點已經被廣泛研究；維生素D3上調蛋

5、白1(VDUP1)/TRX結合蛋白是TRX內源性抑制因子：過度表達VDUP1抑制TRX蛋白表達和其還原活性。研究發(fā)現(xiàn)VDUP1通過與TRX相互作用調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)而在糖尿病、動脈粥樣硬化、心肌細胞肥大等疾病過程表現(xiàn)出重要作用。同樣氧化應激及過多產生的ROS誘導EOS凋亡；但是，哮喘發(fā)病中，EOS存活延長、活性增強，EOS內部必然存在氧化—抗氧化調節(jié)機制，作為參與氧化應激調節(jié)的TRX-VDUP1在哮喘EOS內的表達變化以及可能存在的調

6、節(jié)作用尚不明確；TRX-VDUP1除具有氧化調節(jié)作用外，在細胞內具有對NF-κB等轉錄因子調控作用，故TRX-VDUP1表達變化是否調通過控EOS內部轉錄因子，與EOS活化相關，同樣是不明確的。 所以，在前期研究篩選出的眾多差異表達基因中，選擇VDUP1做進一步研究，目的是探討哮喘發(fā)病中EOS內存在VDUP1表達變化，以及這一表達變化導致細胞活性或存活能力的改變，發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)作中EOS新的調節(jié)機制，再次證實氧化應激在哮喘病理中的重

7、要作用以及控制氧化應激是治療哮喘等疾病新的靶點。 方法 1、以正常自愿者20人、輕到中度急性發(fā)作未經任何治療哮喘病人20人、輕到中度哮喘經吸入糖皮質激素等控制病情穩(wěn)定病人25人為研究對象。 2、應用Percoll不連續(xù)密度梯度法分離正常人及哮喘患者外周血EOS，裂解細胞，Trizol提取總RNA，RT-PCR方法在基因水平驗證VDUP1差異表達。 3、裂解細胞EOS，提取蛋白質，應用WesternBlot

8、ting方法在蛋白質水平驗證哮喘外周血EOSVDUP1差異表達。 3、Percoll不連續(xù)密度梯度法分離一例正常人外周血EOS，將細胞等分4組，1組細胞立即裂解提取總RNA；3組細胞分別給予哮喘EOS相關細胞因子IL-5、IL-5加TRX氧化劑(Diamide)、IL-5加TRX烷化劑(Chloro-2,4-dinitrobenzene)孵育刺激18小時，裂解細胞，提取總RNA；RT-PCR方法半定量表達VDUP1；測定正常血清

9、及各組細胞孵育液中EOS陽離子蛋白(ECP)濃度。比較各組VDUP1表達變化，以及ECP濃度變化。初步探討VDUP1-TRX相互作用在EOS中的調控機制。 4、所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件的OneWayANOVA和BivariateCorrelations進行統(tǒng)計學分析。 結果 1、RT-PCR同時擴增哮喘急性發(fā)作病人、哮喘緩解期病人及正常人外周血嗜酸細胞β-Actin和VDUP1，軟件分析獲得VDUP1

10、/β-Actin比值，三組分別為0.2350±0.0854(n=20)、0.7395±0.1319(n=25)、0.7497±0.0973(n=20)，統(tǒng)計學分析，哮喘急性發(fā)作患者外周血EOSVDUP1基因表達顯著低于正常人(P＜0.001)，而哮喘緩解病人與正常人之間無顯著差異(P＜0.755)。 2、WesternBlotting方法定量測定哮喘急性發(fā)作病人、哮喘緩解病人及正常人外周血EOS提取蛋白中VDUP1和β-Acti

11、n蛋白量，化學發(fā)光顯影后的圖像用Dolphin圖象分析圖像分析儀掃描，Gelpro軟件檢測分析求VDUP1/β-Actin比值三組分別為0.2747±0.0954(n=20)、0.3830±0.0862(n=25)、0.3683±0.1158(n=20)，統(tǒng)計學分析，哮喘急性發(fā)作患者EOSVDUP1蛋白水平表達顯著低于正常人(P＜0.001)，而哮喘緩解病人與正常人之間無顯著差異(P＜0.623)。 3、哮喘急性發(fā)作病人外周血E

12、OSVDUP1表達與病人誘導痰EOS計數(shù)(0.4737±0.0900/mm2)呈負相關性(r=-0.946，p=0.001，t=-12.3822)。 4、急性分離正常人外周血EOSVDUP1/β-Actin為0.5110，血清ECP0.4820ug/L，等量EOS經IL-5刺激孵育后VDUP1/β-Actin為0.3740，孵育上清液ECP量1.3150ug/L；經IL-5和Diamide(TRX氧化劑)同時孵育刺激EOSVDU

13、P1/β-Actin為0.3310，孵育上清液ECP0.5850ug/L；同樣經IL-5和Chloro-2,4-dinitrobenzene(TRX烷化劑)共同孵育刺激EOSVDUP1/β-Actin為0.4120，孵育上清液ECP0.6170ug/L。3組經孵育后EOS與正常細胞比較，VDUP1表達下調；與血清ECP濃度對比，IL-5孵育組細胞孵育液中ECP濃度增高；孵育液中加入TRX還原劑和烷化劑后，孵育液ECP濃度增高不顯著。

14、 結論 1、證實哮喘EOS內VDUP1存在表達變化：急性發(fā)作未經治療控制患者外周血EOS內VDUP1表達較正常人顯著下調，而經治療控制穩(wěn)定哮喘患者外周血EOS內VDUP1表達與正常人無顯著差異。同時發(fā)現(xiàn)哮喘急性發(fā)作未經治療控制患者外周血EOS內VDUP1表達與痰EOS計數(shù)呈負相關性。證明哮喘EOSVDUP1表達變化與EOS引起的氣道炎癥反應程度以及急性期哮喘有重要相關性，當外周血EOS內VDUP1表達下調時，促進EOS動員、

15、活化并在炎癥部位浸潤，加重哮喘病情。 2、發(fā)現(xiàn)哮喘中與EOS活化、增殖相關的細胞因子IL-5能夠誘導EOSVDUP1下調表達，同時使EOS分泌嗜酸細胞陽離子蛋白(ECP)增加。直接證明VDUP1參與哮喘病理過程中EOS活性和功能的調控。 3、發(fā)現(xiàn)在EOS中TRX是VDUP1作用的下游因子，VDUP1對EOS活性的調控是以TRX的內源性負調節(jié)因子的方式、通過VDUP1-TRX相互作用完成的：TRX必需保持活性中心還原狀態(tài)完