維生素D減少RUPP模型大鼠蛋白尿的作用.pdf

1、目的：子癇前期是人類妊娠期特有的疾病，其發(fā)病率約占全部妊娠的2-8％。子癇前期的主要特征為水腫，高血壓，和蛋白尿。嚴重時產生抽搐，昏迷等，是導致早產、胎兒宮內發(fā)育遲緩、新生兒窒息，甚至母嬰死亡的主要原因之一。子癇前期所引起的蛋白尿與腎小球的濾過屏障功能受損有著密不可分的關系。因此，我們有必要弄清子癇前期蛋白尿的發(fā)病機制，找到干預措施。量的臨床和實驗研究證明，活性維生素D能通過抑制腎臟局部組織腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性，抑制腎素基因

2、轉錄，減少糖尿病腎病患者蛋白尿。動物實驗也證明，活性維生素 D類似物可以減輕糖尿病腎病大鼠系膜彌漫性增寬等病理改變，減少足細胞相關蛋白的缺失，減少糖尿病腎病大鼠蛋白尿?？紤]子癇前期孕婦血清中25(OH)D3的水平下降，而維生素D缺乏的孕婦患子癇前期的風險增加的事實，我們假設活性維生素D能緩解子癇前期的蛋白尿現(xiàn)象。為了證實此假設，本實驗用公認的子宮胎盤灌注壓下降(RUPP)模型大鼠模擬子癇前期表型，觀察活性維生素D對腎臟損傷及蛋白尿，以及

3、足細胞相關分子的變化的影響，探討維生素 D在子癇前期中的作用，為其用于緩解子癇前期蛋白尿提供新的實驗證據(jù)。
　　方法：⑴以本實驗室田曉瑜制備的三月齡SD孕大鼠的子宮胎盤灌注壓下降模型（RUPP）為實驗對象，將其分為單純妊娠組（NP group）、RUPP手術組（RUPP group）、RUPP手術+1,25(OH)2D組（RUPP+VD group）。⑵孕18天時，收集24小時尿液，孕19天時，麻醉狀態(tài)下，頸動脈取血4-5ml，取

4、腎臟組織，分別用于尿蛋白，血清和組織中鈣的測定，組化/免疫組化和電鏡觀察，以及目的基因表達的測定。⑶全自動生化分析儀（Beckman Coulter, AU5821, USA）測定尿蛋白，血鈣和組織鈣。⑷使用美國 OMEGA公司總 RNA提取試劑盒提取大鼠腎臟組織總RNA，以18S rRNA做內參，實時定量PCR測定VDR，CYP24A1, nephrin， CD2AP，integrinβ1，podocin和α-actinin-4 mR

5、NA的相對表達量。⑸對大鼠腎臟組織石蠟切片進行PAS染色，檢測腎小球結構變化情況。測量腎小球直徑，計數(shù)腎小球平均細胞核數(shù)。⑹透射電鏡觀察大鼠腎臟組織腎小球濾過屏障結構的變化。⑺對大鼠腎臟組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，分析 PCNA、nephrin的蛋白水平。⑻提取大鼠腎臟組織總蛋白，以β-actin為內參，Western blot測定VDR、PCNA和CD2AP蛋白的相對表達量。⑼采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析，對所測定

6、結果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用x±SD表示，三組間比較用單因素方差（One-way ANOVA）分析，兩兩比較用SNK法。檢驗以P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結果：①雖然大鼠腎皮質中，三組鈣含量（ NP=44.1±18.27， RUPP=44.9±21.66，RUPP+VD=38.44±11.21,μmol/mg pr.×100）并沒有顯著變化，但是RUPP+VD組的血清鈣水平（1.22±0.06 mmol/

7、L），與NP組（1.08±0.06 mmol/L，p<0.01）和RUPP組（1.14±0.1 mmol/L，p<0.05）相比，均有明顯的升高。表明，1,25(OH)2D可以增加血清中的鈣含量，1,25(OH)2D確實發(fā)揮了作用。②RUPP鼠腎組織的維生素D受體（VDR）的mRNA（p<0.001）和蛋白的表達比NP組明顯下降，但兩組蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的 mRNA（p<0.001）和

8、蛋白（p<0.05）水平顯著升高。③CYP24A1是VDR的下游基因。PCR結果顯示，RUPP+VD組腎組織CYP24A1 mRNA的表達較NP組（p<0.001）和RUPP組（p<0.05）均明顯升高。提示，1,25(OH)2D確實是在腎臟中通過與VDR受體結合而來發(fā)揮作用。④RUPP組大鼠的尿蛋白（5.99±1.76 mg/24h）較NP組高（3.5±0.73 mg/24h, p<0.05）；給予1,25(OH)2D后，RUPP+V

9、D組的尿蛋白（3.71±1.38 mg/24h）較RUPP組低（5.99±1.76 mg/24h，P<0.01）。表明，補充1,25(OH)2D可以緩解RUPP大鼠的蛋白尿。⑤光鏡下PAS染色可見大鼠腎臟的腎小球，腎小囊以及腎小管等結構。NP組大鼠的腎臟組織結構正常，腎小球結構完整，未見到腎小球的肥大，毛細血管袢開放良好，無細胞增多，基質無明顯改變。與NP組相比，RUPP組和RUPP+VD組中以上結構未見明顯變化，腎小球直徑和腎小球平均

10、細胞核數(shù)均無明顯變化，表明1,25(OH)2D未能改善腎小球結構。⑥電鏡下可見大鼠腎小球濾過膜的三層結構：血管內皮細胞（EC, endothelial cells）、基底膜（bm, basement membrane）和足細胞足突（箭頭→, podocytic process）。與NP組相比，RUPP組腎小球的濾過膜結構有所改變：大部分足突融合，基底膜增厚，隆起呈丘狀。而給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的基底膜增厚和足細胞融

11、合現(xiàn)象有所改善。說明，RUPP鼠的腎小球雖未出現(xiàn)明顯的病理改變，但腎小球濾過膜超微結構有改變。因此1,25(OH)2D降低RUPP鼠蛋白尿與其逆轉濾過膜結構的改變有關。⑦Western和免疫組化（棕黃色顆粒）的結果顯示，作為增殖相關蛋白的 PCNA在腎小球和腎小管中都有表達，陽性顆粒定位于細胞核中。與NP組相比，其表達水平在RUPP組中有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的 PCNA的蛋白表達水平

12、明顯下降（P<0.01）。提示，1,25(OH)2D降低了增殖相關蛋白PCNA的表達。雖然上述4.2的結果未顯示各組大鼠的腎小球有增殖的跡象，但考慮到分子變化早于結構的變化，我們認為1,25(OH)2D很可能還抑制了RUPP組大鼠腎組織的增殖，降低了蛋白尿。⑧Nephrin是足細胞裂孔隔膜上的分子，參與構成裂孔隔膜的拉鏈狀結構，對維持裂孔膜的完整性起著重要作用。與 NP組大鼠相比，RUPP組大鼠的腎臟中nephrin的mRNA表達水平和

13、蛋白質的表達水平（棕黃染色淺）均明顯減弱（P<0.001）。給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的nephrin的mRNA表達（P<0.001）和蛋白質(棕黃染色加深，P<0.05)表達水平均上調。⑨CD2AP是使裂隙隔膜蛋白nephrin和podocin錨定于足細胞的肌動蛋白細胞骨架。PCR和western的結果顯示，與NP組相比，RUPP組的CD2AP的mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.05）表達水平均顯著降低。與RU

14、PP組相比，給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組CD2AP的mRNA（P<0.001）和蛋白（P<0.05）表達水平均顯著升高。⑩integrinβ1是足細胞和基膜之間的重要黏附分子。PCR的結果顯示，與NP組相比，RUPP組大鼠腎臟integrinβ1 mRNA表達水平顯著下降（P<0.001）。給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組大鼠的integrinβ1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.001），但是integr