維生素D-,3-上調(diào)蛋白1（VDUP1）參與哮喘氧化應(yīng)激的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及意義： 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是嚴(yán)重影響人類健康的慢性呼吸道疾病之一，以氣道非特異性炎癥、氣道反應(yīng)性增高及氣道重建為主要特征。但哮喘發(fā)病的慢性，易變性，發(fā)作性特征顯示疾病發(fā)生機(jī)制復(fù)雜性和難治性。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種基因的調(diào)控，從而決定哮喘各種臨床表型。近來證據(jù)支持基因與環(huán)境因素的協(xié)調(diào)作用在哮喘發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 氧化應(yīng)激與哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，涉及哮喘自然病史、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道血管通透

2、性增加、組織損傷及氣道重建等。盡管如此，有關(guān)氧化應(yīng)激在哮喘的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢。以N-乙酰半胱氨酸(NAC)為代表的抗氧化治療，廣泛應(yīng)用于肺部疾病治療，但其臨床實踐仍較為有限。這可能與氧化應(yīng)激分子如活性氧(ROS)具有易變性特點、能夠活化多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及當(dāng)前對ROS引起的確切生理及病理學(xué)作用效果尚不清楚有關(guān)。因此深入開展哮喘氧化應(yīng)激機(jī)制研究，尋找疾病特異的氧化應(yīng)激因素，可能為哮喘防治提供新的理論依據(jù)和作用靶點。 氣

3、道上皮細(xì)胞(AEC)具有復(fù)雜的屏障功能，作為防御吸入有害物質(zhì)及病原微生物的第一道防線。近十年來，“AEC缺陷學(xué)說”逐漸成為解釋哮喘發(fā)病機(jī)制的主流觀點。AEC與多種環(huán)境因素(包括內(nèi)環(huán)境)相互作用，通過AEC及上皮.問充質(zhì)營養(yǎng)單元(EMTU)在啟動和維持氣道炎癥及氣道重建上發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用。目前認(rèn)為，AEC的結(jié)構(gòu)完整性缺陷或功能紊亂是哮喘的啟動環(huán)節(jié)。哮喘病人AEC經(jīng)常處于外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激環(huán)境下，當(dāng)AEC出現(xiàn)抗氧化功能缺陷或過度氧化應(yīng)激

4、時，這種平衡被打破，引起固有免疫系統(tǒng)及獲得性免疫系統(tǒng)活化。研究已經(jīng)證實哮喘患者AEC更易受到氧化應(yīng)激而發(fā)生損傷，也更易于凋亡，增加AEC通透性。這充分提示AEC氧化抗氧化失平衡在哮喘發(fā)病中的重要作用。 本研究關(guān)注主要靶點：維生素D3上調(diào)蛋白1(VDUP1)是2005年本實驗室初次篩選并證實與哮喘嗜酸粒細(xì)胞(EOS)存活、炎癥介質(zhì)釋放及肺功能改變明顯相關(guān)的基因。既往研究支持：VDUP1作為早期反應(yīng)基因，具有多種生物學(xué)功能，參與了氧

5、化應(yīng)激，應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞生長與分化，脂質(zhì)代謝及粘膜免疫等過程，證實與糖尿病，腫瘤，心血管等復(fù)雜疾病密切相關(guān)。VDUP1是主要氧化還原調(diào)控蛋白硫氧還蛋白(TRX)的關(guān)鍵抑制因子，而TRX和谷胱苷肽(GSH)系統(tǒng)是并行重要的抗氧化調(diào)控系統(tǒng)。 因此本研究即是在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討VDUP1在哮喘氧化應(yīng)激的可能作用及參與AEC氧化應(yīng)激調(diào)控的分子機(jī)制，為未來針對哮喘氧化應(yīng)激治療及干預(yù)提供新的理論依據(jù)。 方法： 1.

6、建立小鼠哮喘模型，探討VDUP1在哮喘肺組織的表達(dá)及分布情況，分析抗氧化劑NAC對VDUP1的干預(yù)作用。 SPF級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、哮喘組及哮喘+NAC處理組，每組5只。卵蛋白(OVA)誘導(dǎo)建立哮喘模型，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測肺組織VDUP1mRNA表達(dá)水平，免疫組化法檢測VDUP1在肺組織的分布及蛋白表達(dá)情況。 2.建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)非致

7、死性和致死性氧化應(yīng)激模型，研究VDUP1、TRX在HBE表達(dá)與定位情況。 3.構(gòu)建VDUP1RNA干擾(siRNAVDUP1)質(zhì)粒，觀察siRNAVDUP1后對細(xì)胞生長、凋亡的影響及在氧化應(yīng)激耐受中的作用。 4.研究VDUP1在H2O2誘導(dǎo)HBEVEGF表達(dá)作用及可能機(jī)制。 結(jié)果： 1.VDUP1在哮喘肺組織表達(dá)明顯增加，而NAC進(jìn)一步增加VDUP1表達(dá)。VDUP1主要定位在AEC和少量間充質(zhì)細(xì)胞。

8、 2.H2O2可以增加HBEVDUP1/TRX表達(dá)，在更低濃度可以促進(jìn)VDUP1表達(dá)，同時促進(jìn)兩者向細(xì)胞核及細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位。VDUP1和TRX熒光表達(dá)強(qiáng)度與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。 3.siRNAVDUP1轉(zhuǎn)染后對正常HBE生長無顯著影響，但在氧化應(yīng)激作用下，可以減少較高濃度H2O2引起HBE的凋亡率。 4.VDUP1參與H2O2誘導(dǎo)HBEVEGF表達(dá)的作用及可能機(jī)制。 ①H2O2可以顯著增加HBEVEGF表達(dá)，Ly29

9、4002(10μM)可以完全拮抗這種效果。 ②Ly294002(10μM)對VDuP1/TPX/Jab1表達(dá)無顯著影響，免疫熒光顯示可以減少VDUP1向細(xì)胞膜和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，對Jab1、TRX表達(dá)及定位情況未見顯著影響。 ③siRNAVDUP1可以稍增加H2O2誘導(dǎo)HBEVEGF表達(dá)，但尚無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.VDUP1與哮喘氧化應(yīng)激有關(guān)，可能作為抗氧化的標(biāo)志之一。 2.VDUP1可能是調(diào)節(jié)H