源于一種纖維單胞菌的聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的分離純化及部分性質(zhì)的鑒定.pdf

1、目的：分離純化一種由纖維單胞菌屬(Cellulomonose sp．)的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的具有聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的性質(zhì)的蛋白酶(暫命名為聚阿拉伯糖內(nèi)切酶)并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)鑒定。本課題選取能將聚阿拉伯半乳糖(Arabinogalactan,AG)水解成六聚阿拉伯糖片段的內(nèi)切酶作為研究對(duì)象。這種水解酶存在于一種細(xì)菌(該細(xì)菌尚無(wú)確切的名稱，但它的生物性質(zhì)與纖維單胞菌相似)的外分泌液中。鑒于目前還沒(méi)有聚阿拉伯糖內(nèi)切酶基因序列的相關(guān)報(bào)道，所以分離純化成為

2、獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)的有效途徑。AG是分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，是由聚阿拉伯糖和聚半乳糖組成的具有復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的大分子聚糖。由于AG在結(jié)構(gòu)上具有特殊性，所以常被作為抗結(jié)核藥物作用的靶點(diǎn)。正因?yàn)槿绱?，有關(guān)AG的結(jié)構(gòu)研究一直都沒(méi)有中斷過(guò)。其中，尋找有效的手段水解AG是一個(gè)重要的研究方面。使用傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法常常在降解AG的過(guò)程中改變個(gè)別糖基的結(jié)構(gòu)，無(wú)法獲得原始的結(jié)構(gòu)信息，而改用酶水解則可以有效的解決這一問(wèn)題。使用專一的內(nèi)切酶將AG大分子降解

3、成合適的片段，再用質(zhì)譜和核磁共振方法確定這些小片段的分子結(jié)構(gòu)，并將得到的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行組合，最終就可以得出AG的完整結(jié)構(gòu)。而施行此方法的前提條件是得到合適的聚糖內(nèi)切酶。本課題擬分離出一種六聚阿拉伯糖內(nèi)切酶，并將它作為一種新型的工具酶，用于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)分析；而對(duì)該酶的性質(zhì)的鑒定，則可以作為進(jìn)一步研究同類水解酶的依據(jù)。 方法：使用多種不同的層析方法從纖維單胞菌屬的細(xì)菌發(fā)酵液中純化聚阿拉伯糖內(nèi)切酶，并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)鑒定。具體方

4、法歸納如下：1)建立穩(wěn)定可信的酶活性測(cè)定方法。利用薄板層析(TLC)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)底物與產(chǎn)物的有效分離，并利用該方法來(lái)檢測(cè)聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的活性，結(jié)合Quanti-Scan軟件進(jìn)行定量分析。2)以纖維單胞菌屬細(xì)菌的發(fā)酵液為原料，通過(guò)DEAE-Sepharose離子交換層析，Sephacryl S-300分子篩和Blue-Dye活性染料親和層析三種手段串聯(lián)，逐步純化聚阿拉伯糖內(nèi)切酶，在純化過(guò)程中，用上述酶活性測(cè)定方法追蹤酶活性。3)純化后的樣品

5、經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，測(cè)定其純度及相對(duì)分子質(zhì)量，用TLC法與Quanti-Scan軟件結(jié)合測(cè)定酶活力，測(cè)定反應(yīng)最適溫度和最適pH，用Lineweare-Burk雙倒數(shù)做圖法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性。 結(jié)果：1)本文利用TLC實(shí)現(xiàn)了大分子底物AG與底物被水解釋放的小分子寡聚阿拉伯糖產(chǎn)物的分離，生成產(chǎn)物的量可以經(jīng)Ouanti-Scan軟件掃描定量。該方法的關(guān)鍵在于展層劑的選擇。為了達(dá)到最佳的分離效果，我們根據(jù)不同糖片段的極性差異來(lái)

6、選擇展層劑。分別選取乙醇，異戊醇，正丁醇和乙酸作為展層劑，并將其按不同比例混合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定正丁醇：乙酸(1：1)作為展層劑。該方法具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確和可以定量的特點(diǎn)，而且可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。這些特點(diǎn)使該方法適合在聚阿拉伯糖內(nèi)切酶純化時(shí)進(jìn)行酶活性的監(jiān)測(cè)。2)在細(xì)菌發(fā)酵液中，目標(biāo)蛋白的含量極低，并且殘留了粘度很高的發(fā)酵原料(結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的成分)，這些因素使得后續(xù)的純化步驟更加困難。由于對(duì)該酶的理化性質(zhì)一無(wú)所知，所以，我們嘗試

7、了多種純化方法，并從中篩選了幾種有效的柱層析。其中，DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析，不僅可以在短時(shí)間內(nèi)處理大量的樣品，而且可以除去雜蛋白，并在一定程度上濃縮目的蛋白，因此適合作為純化的第一步驟。Sephacryl S-300柱層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小的不同來(lái)進(jìn)行分離的，經(jīng)過(guò)這一步純化，酶蛋白純度和比活性均得到了提高，同時(shí)也去除了發(fā)酵液中高粘度的雜質(zhì)。Blue-Dye是非特異性的親和層析柱，它可以使目的蛋白的純度和比活性得

8、到極大的提高。聯(lián)合使用這些高效的柱層析方法得到了單一的蛋白條帶，并具有聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的活性。3)對(duì)純化后的樣品進(jìn)行性質(zhì)鑒定：該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為45 kD，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)規(guī)律，在40℃反應(yīng)條件下，米氏常數(shù)Km為2.5mg/ml，最大反應(yīng)速率Vmax為0.083μmol/L.min，最適pH為8.0，pH 6.0-9.0時(shí)較穩(wěn)定。最適溫度為40℃，在40℃以下較穩(wěn)定，超過(guò)50℃時(shí)酶活力開(kāi)始下降。

9、蛋白酶比活性為15.42×103(U/ug)，純化倍數(shù)為77.1。 結(jié)論；本課題建立的聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的活性檢測(cè)方法具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確及可定量的特點(diǎn)。雖然通過(guò)HPLC，可以對(duì)糖分子進(jìn)行定性和定量分析，但是用這種方法來(lái)監(jiān)測(cè)在純化過(guò)程中的酶活性過(guò)于繁瑣。所以，使用TLC與Qnanti-Scan相結(jié)合的酶活性測(cè)定方法，它更適用于在酶純化過(guò)程中追蹤酶活性。通過(guò)對(duì)聚阿拉伯糖內(nèi)切酶的純化，發(fā)現(xiàn)該酶在發(fā)酵液中的含量極低，由于發(fā)酵原料——AG

10、很難獲取，所以無(wú)法大量制備高濃度的粗酶，這對(duì)純化是一個(gè)挑戰(zhàn)。針對(duì)這一問(wèn)題，在純化操作，蛋白含量測(cè)定和酶活性測(cè)定方法上都進(jìn)行了有效的嘗試和改進(jìn)，這為今后分離低含量的蛋白酶積累了經(jīng)驗(yàn)。本課題分離純化了一種聚阿拉伯糖內(nèi)切酶，并鑒定了它的部分性質(zhì)。該酶是一種阿拉伯糖內(nèi)切酶，能水解AG產(chǎn)生六聚阿拉伯糖。水解產(chǎn)物是AG末端的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)與分枝桿菌的生理特點(diǎn)及致病機(jī)理密切相關(guān)，可以作為抗結(jié)核藥物的作用靶點(diǎn)。綜上所述，聚阿拉伯糖內(nèi)切酶不僅是一