塔格糖的生物制備及L-阿拉伯糖異構(gòu)酶性質(zhì)研究.pdf

1、塔格糖(D-tagatose)屬于稀有糖，是一種在自然界中存在較少的單糖，其甜味類似于蔗糖，而熱量值較低，同時(shí)還具有抗氧化、降低血糖、益生元及防齲齒的功能特性。塔格糖的生物轉(zhuǎn)化主要利用L-阿拉糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，AI)異構(gòu)化半乳糖a本論文主要研究：篩選高產(chǎn)AI的乳酸菌；優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)AI的工藝參數(shù)；乳酸菌AI的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)；AI酶活性部位的化學(xué)修飾；滲透乳酸菌細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化塔格糖的工藝條件。

2、 利用半胱氨酸．咔唑法、薄層層析法快速篩選得到產(chǎn)AI的乳酸菌Lactobacillus SK-2，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生化特性，結(jié)合16S rDNA，判定Lactobacillus SK-2屬于植物乳酸桿菌，命名為L(zhǎng)actobacillus plantarum SK-2，GenBank accession number：DQ480531。 對(duì)L．plantarum SK-2發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化及AI產(chǎn)生機(jī)理探討，結(jié)果表明，5 g/L葡萄

3、糖、玉米漿為碳源和氮源時(shí)，AI酶活最高；有機(jī)氮源效果優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源；發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果：發(fā)酵初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度37℃，接種量3％，培養(yǎng)時(shí)間12 h；L-5可拉伯糖是AI產(chǎn)生的最適誘導(dǎo)物。 經(jīng)過(guò)溶菌酶處理、超聲波破碎、硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseCL-6B Fast Flow離子交換色譜和Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾等步驟，純化得到LPAI(Lactobacillus plantarumSK-2 AI)，

4、SDS-PAGE呈現(xiàn)單一條帶，HPLC檢測(cè)純度達(dá)96％，比酶活升高21倍，達(dá)到253 U/mg，回收率11％。由SDS-PAGE得到LPAI相對(duì)亞基分子質(zhì)量為59.6 k，而凝膠過(guò)濾色譜求得LPAI的相對(duì)分子量約為172.3k，因此，推斷LPAl分子內(nèi)有3個(gè)亞基，是一種三聚體酶。 純化的LPAI最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為7.0。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在50℃條件下保溫2 h，酶活保持100％；在pH 4.5-8.5環(huán)境(50

5、℃)保存1 h后測(cè)定殘余酶活在80％以上，表明酶在pH 4.5-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。 Al<'3+>，K<'+>和Na<'+>對(duì)酶活幾乎沒(méi)有影響，而Mn<'2+>，F(xiàn)e<'2+>，F(xiàn)e<'2+>，Ca<'2+>，Ba<'2+>和Ze<'2+>增強(qiáng)了酶活，Mn<'2+>增強(qiáng)酶活最大，添加20 mmol/L Mn<'2+>酶活力最高；EDTA、Cu<'2+>，Co<'2+>，Ag<'+>，pb<'2+>和Mg<'2+>則分別對(duì)酶產(chǎn)生了

6、不同程度的抑制作用，而Hg<'2+>完全抑制了酶活。 LPAI最適底物為L(zhǎng)-阿拉伯糖，其次為D-半乳糖，另外，LPAI對(duì)海藻糖、木糖和果糖也具有催化作用；不同糖醇對(duì)LPAI均產(chǎn)生了抑制作用，木糖醇、甘露糖醇抑制作用較弱，而L-阿拉伯糖醇則完全抑制了酶活。采用Lineweaver-Burk作圖法，求得LPAI作用于D-半乳糖和L-5可拉伯糖的特征常數(shù)分別為K<,m> 119 mmol/L，V<,max>5.6μmol/min/L和

7、30 mmol/L，352.7μmol/min/L。 純酶N-端結(jié)構(gòu)前十個(gè)氨基酸殘基連接依次為：MLSVPDYEFW，發(fā)現(xiàn)與Lactobacillusplantarum、Lactobacillus pentosus來(lái)源的AI一致；進(jìn)化同源性表明乳酸菌來(lái)源的AI氨基酸序列高度保守。 LPAI在不同pH環(huán)境下紫外-可見(jiàn)掃描發(fā)現(xiàn)，在280 nm吸收峰主要是色氨酸殘基，隨pH增加，280 nm吸收峰強(qiáng)度增加，且吸收峰波長(zhǎng)有輕微紅

8、移，表明色氨酸基團(tuán)有可能從疏水區(qū)移動(dòng)或翻轉(zhuǎn)到酶蛋白分子外部。 ApoLPAI(脫除Mn<'2+>)加入10 mM Mn<'2+>時(shí)，LPAI酶活又恢復(fù)到原來(lái)的水平。HoloLPAI(原酶)和ApoLPAI進(jìn)行差示掃描量熱分析表明，HoloLPAI熱穩(wěn)定性高于ApoLPAI，因此認(rèn)為L(zhǎng)PAl分子中結(jié)合的Mn<'2+>對(duì)維持酶活力至關(guān)重要，而且其與酶蛋白結(jié)合形成的特殊構(gòu)象對(duì)酶的熱穩(wěn)定性也起著重要作用。 LPAI熒光分析表明，激發(fā)光波

9、長(zhǎng)為295 nm時(shí)，最大發(fā)射熒光強(qiáng)度為335 nm。對(duì)熒光產(chǎn)生貢獻(xiàn)的色氨酸殘基可能位于一個(gè)疏水區(qū)環(huán)境中，除了在335 nm處有一發(fā)射峰外，在377nm處也有個(gè)小峰。 圓二色性分析表明，HoloLPAI脫除Mn<'2+>后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其中，β-折疊由14.8％減少為0，回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)由0變?yōu)?7.4％。隨著結(jié)構(gòu)變化，HoloLPAI中更穩(wěn)定的β-折疊減少，導(dǎo)致．ApoLPAI具有較低活性，耐熱性變差。 NB

10、S、PMSF和DEPC化學(xué)修飾造成酶活下降，說(shuō)明構(gòu)成LPAI活性中心的必需氨基酸殘基有色氨酸、絲氨基酸和組氨酸。NBS滴定表明該酶含有9個(gè)色氨酸殘基，進(jìn)一步用Levy法分析化學(xué)試劑修飾后殘余酶活力與時(shí)間、修飾劑濃度的關(guān)系，計(jì)算出活性中心必需色氨酸殘基數(shù)目為2，組氨酸殘基和絲氨酸殘基均為1個(gè)。 底物保護(hù)試驗(yàn)證明：色氨酸殘基、絲氨酸殘基處在與底物結(jié)合部位。組氨酸不處在底物結(jié)合位點(diǎn)，可能位于催化活性部位。 酶的熒光淬滅研究發(fā)現(xiàn)

11、，加入3 mg/ml半乳糖，酶的發(fā)射光譜峰紅移至345 nm，峰的強(qiáng)度降低，導(dǎo)致熒光淬滅。同樣加入100μmol/L NBS時(shí)，且最大吸收峰紅移至340 nm,、導(dǎo)致熒光淬滅。 酶經(jīng)NBS修飾后，α-螺旋從70.2％下降到29.8％，β-折疊則完全消失，回轉(zhuǎn)則從0增加到32.6％。NBS修飾色氨酸殘基造成酶活力下降，從二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可知，修飾導(dǎo)致底物結(jié)合部位的色氨酸殘基周圍環(huán)境發(fā)生明顯改變，從而造成與底物結(jié)合能力下降。