d-阿拉伯糖醇高產(chǎn)多形漢遜酵母重組菌株選育及其發(fā)酵工藝研究.pdf

1、D-阿拉伯糖醇，已在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的直接提取法和化學合成法的生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)率低，底物昂貴等弊端，限制了D-阿拉伯糖醇的規(guī)模化生產(chǎn)。生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇被公認為綠色生產(chǎn)方法，也是最有前景的生產(chǎn)方法之一。但是目前用于發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的菌株普遍存在產(chǎn)率低，副產(chǎn)物多等問題。因此，選育出一株遺傳性能良好的高產(chǎn)菌株尤為重要。
　　本研究首先對低能N+注入多形漢遜酵母DL-1（Hansenula

2、polymorphaDL-1，H.polymorpha DL-1）的注入?yún)?shù)進行考察，確定了最佳的低能離子注入?yún)?shù)。進而根據(jù)D-阿拉伯糖醇高產(chǎn)菌株有耐高滲的特性，建立了高糖培養(yǎng)基初篩，紙色譜法和高效液相色譜法聯(lián)合使用進行復(fù)篩的高通量篩選方法。再利用離子束轉(zhuǎn)基因技術(shù)介導(dǎo)多形漢遜酵母基因組DNA隨機轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母，結(jié)合高通量篩選方法，創(chuàng)建D-阿拉伯糖醇高產(chǎn)重組菌株。隨后對高產(chǎn)重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的發(fā)酵工藝進行考察，確定了高產(chǎn)重組

3、菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的最佳發(fā)酵工藝。研究結(jié)果如下:
　　(1)對多形漢遜酵母低能離子注入劑量和能量進行優(yōu)化，依據(jù)多次重復(fù)試驗計算出注入菌株的存活率，獲得“馬鞍形”曲線，確定出低能N+注入多形漢遜酵母的最佳條件:注入劑量:2.5×1016 ion/cm2;注入能量:25keV，真空條件下，脈沖注入10s，間隔10s。
　　(2)建立了高通量篩選方法，即高糖培養(yǎng)基初篩，紙色譜法和高效液相色譜法復(fù)篩的組合利用的高通量、快速篩

4、選方法。
　　(3)運用低能離子束技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)重組菌株，結(jié)合高通量篩選方法篩選出了一株產(chǎn)量為113.76g/L的高產(chǎn)工程菌株，被命名為H.polymorphaDLg4-14。
　　(4)以H.polymorpha DLg4-14為研究對象，運用正交試驗確定了其最佳發(fā)酵條件，分別為接種時間21h，接種量5％，葡萄糖添加量為250g/L，酵母膏:硫酸銨(mol/mol)=10∶1。其中，葡萄糖的添加量對D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量有著顯