ACA對(duì)CRM1依賴的出核運(yùn)輸抑制作用的初步研究.pdf

1、乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(1’-acetoxychavicol acetates，ACA)是一種從高良姜中提取的天然小分子化合物，具有抗腫瘤，抗過敏，抗真菌，保胃，抗氧化和黃嘌呤氧化酶抑制劑等多種生物學(xué)功能。但是ACA的藥物作用機(jī)理的相關(guān)研究還停留于初級(jí)階段；我們的研究發(fā)現(xiàn)ACA可能是通過抑制CRM1依賴的蛋白出核運(yùn)輸而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能的。 我們選取了ZR-75-30，SK-BR-3，MDA-MB-453，MCF-7，Bcap-37

2、五種乳腺癌細(xì)胞系，分別檢測(cè)了ACA對(duì)他們的毒性作用，發(fā)現(xiàn)ACA在10μmol/L濃度水平即對(duì)這些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。我們還對(duì)乳腺細(xì)胞HBL-100進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)同樣的濃度水平下沒有明顯的毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了ACA可以有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。 為了研究ACA對(duì)蛋白出核運(yùn)輸?shù)挠绊?，我們?cè)趯?duì)融合酵母Schizosaccharomyces pombe(S.Pombe)的研究中使用了包含SV40T抗原NLS和Rev蛋

3、白NES序列的GST-GFP融合蛋白(GST-NLS-GFP-NES)，從而可以很方便地跟蹤C(jī)RMl依賴的蛋白出核運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ACA可以有效的阻斷CRMl依賴的NES信號(hào)蛋白的出核，使相關(guān)的蛋白大量聚集在細(xì)胞核中。 初步判定ACA對(duì)CRM1正常功能的抑制作用后，我們預(yù)測(cè)ACA可能是通過與CRM1直接結(jié)合而影響CRM1的生物學(xué)功能，于是進(jìn)行了ACA對(duì)LMB的競(jìng)爭(zhēng)性分析。LMB是一種已經(jīng)確定的CRM1的抑制劑，可以直接與CRM

4、1蛋白相結(jié)合并改變CRM1的構(gòu)象進(jìn)而影響其正常功能。在競(jìng)爭(zhēng)性分析中我們發(fā)現(xiàn)ACA在較高濃度時(shí)可以與LMB競(jìng)爭(zhēng)CRM1上的結(jié)合位點(diǎn)。 為了對(duì)ACA與CRMl相互作用作更深一步的研究，我們構(gòu)建了CRMl真核表達(dá)載體pcDNA-CRMl-HA表達(dá)CRMl全長(zhǎng)，以及將CRMl分為三個(gè)片段分別進(jìn)行表達(dá)的原核表達(dá)載體pGEX-4T2-CRMl-I(1-1029)，pGEX-4T2-CRMl-Ⅱ(985-2199)，pGEX-4T2-CRMl

5、-Ⅲ(2110-3213)。 我們利用pcDNA-CRMl-HA進(jìn)行體外翻譯得到的CRMl蛋白，分析ACA對(duì)CRMl在天然聚丙烯酰胺凝膠上遷移率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的ACA可以使CRMl的遷移率明顯提高；這說明高濃度ACA的存在使CRMl的構(gòu)象發(fā)生了變化，起到與LMB相似的效果。 通過以上實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)ACA對(duì)CRM1依賴性的蛋白出核運(yùn)輸?shù)囊种谱饔眉捌渥饔脵C(jī)制進(jìn)行了具有啟發(fā)性的初步研究。先前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中普遍認(rèn)為A