間充質(zhì)干細胞通過調(diào)控枯否細胞M1型和M2型改善肝纖維化的實驗研究.pdf

1、肝硬化是由各種因素引起慢性肝臟損害并發(fā)展至晚期階段的一類疾病，其發(fā)病率和死亡率均呈逐年增高的趨勢，在全世界范圍內(nèi)，每年由肝硬化導(dǎo)致的死亡人數(shù)多達103萬，肝硬化已在最常見的死亡病因中位列第14位[1]，嚴重危害著人類的健康。目前采用內(nèi)科常規(guī)的保肝和對癥治療難以獲得良好療效，其有效手段仍然是原位肝移植，但是由于供肝缺乏、花費巨大等因素極大地限制了肝移植的臨床應(yīng)用。因此，明確肝纖維化的發(fā)病機制，在早期進行預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化至關(guān)重要。

2、　　近年來，間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）被發(fā)現(xiàn)不僅具有自我更新、多向分化等潛能，其免疫調(diào)節(jié)作用也越來越受到臨床各個領(lǐng)域研究者的重視。研究發(fā)現(xiàn) MSCs可免疫調(diào)節(jié)慢性肝纖維化的炎癥，能夠明顯改善肝功，延長終末期肝病患者的生存期，這為肝臟組織損傷修復(fù)和細胞治療帶來了切入點和新希望。
　　肝臟中有一類重要的非實質(zhì)免疫細胞，即枯否細胞（Kupffer cells，KCs），它是機體內(nèi)一道重要防線，

3、在維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)有研究報道枯否細胞有兩種不同的激活途徑，分別產(chǎn)生兩種不同類型的 KCs，即 M1型和M2型。這兩型細胞之間的平衡與腫瘤、感染及組織損傷等炎癥性疾病密切相關(guān)。
　　本課題組前期對MSCs調(diào)節(jié)KCs的研究進行了探索。研究發(fā)現(xiàn)：將含有磷酸二鈉脂質(zhì)體的溶液經(jīng)尾靜脈注射給肝纖維化小鼠（CCl4肝損傷模型），用于剔除 KCs后，給予小鼠MSCs治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未剔除KCs組的肝纖維化小鼠治療效果明顯優(yōu)于

4、剔除KCs的治療組。進一步研究表明，未剔除KCs組的小鼠肝內(nèi)M2型KCs相關(guān)因子CD206、Arg-1、IL-10的mRNA表達明顯升高，而M1型相關(guān)的CD68、TNF-α的mRNA表達降低。提示，肝臟KCs參與了MSCs治療肝纖維化的過程，可能通過誘導(dǎo) M2型肝臟KCs的激活來減輕肝纖維化。
　　本研究是在前期探索性研究的基礎(chǔ)上，仍采用經(jīng)典的CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型，并對肝纖維化小鼠進行同源MSCs移植治療，評價M

5、SCs移植后的治療效果，并主要探討MSCs通過促進KCs類型轉(zhuǎn)換治療肝纖維化的機制，以期為臨床應(yīng)用MSCs治療肝纖維化提供新的理論研究依據(jù)。
　　【目的】
　　1.明確CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷不同階段KCs亞群M1/M2的比例變化；
　　2.闡明MSCs是否通過調(diào)控KCs亞群M1/M2的比率而參與肝損傷修復(fù)。
　　【方法】
　　1.利用CCl4腹腔注射8周以誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型。在肝纖維化造模的第2、4、6、8

6、w分別收集小鼠血清、采取小鼠肝臟，前者用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT及白蛋白ALB的水平；后者首先利用H&E染色方法觀察模型小鼠的肝臟炎癥，以及采用天狼星紅染色方法量化分析肝纖維化程度，然后將肝臟組織連續(xù)切片，分別單標(biāo)CD68和CD206進行免疫組化染色，觀察兩型KCs在肝損傷不同時間段的變化；
　　2.采用原位膠原酶灌注法分離小鼠肝損傷不同時間段(2、4、6、8w)的肝非實質(zhì)細胞，經(jīng)備皮、開腹、插管后進行原

7、位灌注，離心后得到肝非實質(zhì)細胞，再將CD68和CD206作為雙標(biāo)進行染色，用流式細胞儀檢測M1和M2在肝損傷不同時間段的百分比；
　　3.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)MSCs，在倒置顯微鏡和浮雕顯微鏡下觀察細胞形態(tài)以及當(dāng)MSCs生長至第三代時利用流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記物進行鑒定；
　　4.將CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠隨機分為三組，分別是橄欖油對照組、未治療組和治療組。將同品系小鼠 MSCs經(jīng)尾靜脈移植給治療組（1x10

8、6cells/mice）。同樣通過血清學(xué)檢測小鼠肝功能水平（AST、ALT、ALB），H&E和天狼星紅染色檢測肝組織炎癥和纖維化程度；采用膠原酶灌注法分離小鼠肝非實質(zhì)細胞，通過雙標(biāo)進行檢測MSCs治療后的兩型KCs的百分比水平；
　　5.采用Real-time PCR方法測肝損傷以及MSCs治療后，不同時間段內(nèi)肝臟M1型（TNF-α、MCP1、IFN-γ）和M2型（Arg1、CD163、IL-10）相關(guān)因子表達水平。
　　【

9、結(jié)果】
　　1.腹腔注射CCl4第8w時，H&E染色和天狼星紅染色觀察到小鼠肝臟組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤、形成顯著的纖維化。血生化檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)氨酶水平增高而白蛋白水平顯著降低，提示小鼠肝纖維化模型建立成功。
　　2.免疫組織化學(xué)染色和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷過程中，CD68標(biāo)記的M1型KCs逐漸升高，在第8w時表達明顯增強，達到高峰。CD206標(biāo)記的M2型KCs從第4w后逐漸升高，在第6w達到高峰

10、，而后逐漸降低。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，肝臟組織中M1型相關(guān)因子（TNF-α、MCP1、IFN-γ）從第2w逐漸增高，到第8w時表達最高，而 M2型相關(guān)因子（Arg1、CD163、IL-10）從第4w逐漸升高，在第6w達到高峰，隨后逐漸降低。提示：在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的不同階段中，M1和M2型KCs的比例發(fā)生了變化。
　　3.對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠給予同源MSCs移植后，MSCs移植組的治療效果明顯優(yōu)于其

11、他組，主要表現(xiàn)在小鼠肝組織損傷程度改善（可見H&E染色和天狼星紅染色），以及血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低而白蛋白水平增高（可見血生化檢測）。
　　4.對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠進行MSCs移植后，免疫組織化學(xué)染色和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，MSCs移植組中CD68標(biāo)記的M1型KCs表達降低，CD206標(biāo)記的M2型KCs表達增高。同時，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，肝臟KCs的M1型相關(guān)因子（TNF-α、IFN-γ）表達水平降低，而M2

12、型相關(guān)因子（CD163、IL-10）表達水平增高。提示：MSCs可能通過促進枯否細胞M1型向M2轉(zhuǎn)換而參與肝損傷修復(fù)。
　　【結(jié)論】
　　本研究發(fā)現(xiàn)：(1) KCs參與了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的病理損傷過程，在炎癥早期的KCs可能以M1型促炎為主，炎癥中晚期以M2型抗炎為主。當(dāng)M1/M2型細胞比率失衡，可能導(dǎo)致炎癥加重，造成肝損傷后恢復(fù)不良；(2)在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠病理損傷過程中，MSCs可能通過誘導(dǎo)KCs的M1