EGFP-SPIO雙標(biāo)間充質(zhì)干細胞在肝纖維化大鼠肝內(nèi)定居的示蹤研究.pdf

1、我國慢性乙肝患者約2000萬，每年死于晚期肝硬化和肝癌的患者高達50萬，是全球晚期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)。目前肝臟移植是作為終末期肝病的主要根治方法，然而由于器官短缺倒置該技術(shù)所惠及人群有限。骨髓干細胞肝內(nèi)移植治療肝病目前成為實驗及臨床研究的熱點，尤其是干細胞在體內(nèi)的分化能力和定居、定位情況的研究。傳統(tǒng)細胞標(biāo)記方法的缺陷是需離體狀態(tài)下進行光鏡或/和電鏡組織學(xué)的檢測分析，因此考慮到今后的臨床應(yīng)用，活體檢測方法需要深入研究。自從Weissle

2、der于1999年提出分子影像學(xué)的概念后，利用分子影像學(xué)的方法對移植細胞進行監(jiān)測成為研究的熱點。 目的： 通過多聚賴氨酸（PLL）介導(dǎo)的氧化鐵納米顆粒（SPIO）標(biāo)記及EGFP慢病毒感染雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）進行雙標(biāo)記后，經(jīng)盲腸靜脈移植入雌性肝纖維化大鼠，利用磁共振成像（MRI）技術(shù)對其進行活體示蹤，并采用病理及熒光實時定量PCR檢測移植細胞在大鼠體內(nèi)的分布、遷移和定居情況，評價SPIO—PLL對干細胞的

3、標(biāo)記及活體示蹤效果。 方法： 1.采用密度梯度離心+貼壁法獲取雄性大鼠BMSCs，經(jīng)體外傳代、培養(yǎng)、純化，通過流式細胞儀檢測BMSCs細胞表型（CD29、CD45和CD11b）及體外成骨成脂誘導(dǎo)對干細胞進行鑒定。 2.通過慢病毒感染將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入BMSCs基因組，使其持續(xù)穩(wěn)定表達EGFP。 3.采用鐵濃度為25μg/mL的SPIO—PLL標(biāo)記EGFP—BMSCs，電鏡觀察細胞內(nèi)

4、鐵顆粒，普魯士藍染色顯示細胞內(nèi)鐵并計算標(biāo)記率，分光光度計測量細胞內(nèi)鐵含量；通過觀察標(biāo)記后細胞的EGFP熒光情況、MTT測細胞增殖能力、臺盼藍染色測細胞活力、Hoest染色觀察細胞凋亡情況、成骨成脂誘導(dǎo)檢測細胞多向分化能力等評價SPIO—PLL標(biāo)記對BMSCs生物學(xué)特性的影響。 4.用臨床1.5T MR對不同數(shù)量級的磁標(biāo)記細胞行MR掃描，掃描序列包括SE序列T1WI，快速自旋回波（FSE）序列T2MI及梯度回波序列（GRE）T2*

5、WI，觀察細胞數(shù)量與MR信號變化的關(guān)系。 5.腹腔注射四氯化碳建立雌性大鼠慢性肝纖維化模型，通過血清肝功能和肝纖維化生化指標(biāo)以及病理判斷肝纖維化模型的建立。 6.模型大鼠分為A、B、C三組，分別經(jīng)盲腸靜脈注射SPIO—EGFP—BMSCs（4×106 cells）、SPIO2.6μL、EGFP—BMSCs（4×106 cells）。于注射前、注射后1小時、24小時及3、5、7、10、12、15天行MR檢查，測量肝臟信噪比

6、（SNR）。 7.分別于細胞移植后24小時及7、15和42天處死兩只大鼠，取肝、肺及腎臟本行冰凍切片觀察EGFP熒光情況，并行EGFP免疫組織化學(xué)及普魯士藍染色相互印證。 8.分別取細胞移植后24小時及7、15天和6周大鼠肝、肺、脾、腎、心臟及肌肉組織，提取基因組DNA，通過熒光實時定量PCR檢測Sry基因的拷貝數(shù)觀察移植細胞在體內(nèi)分布、遷移和定居情況。 結(jié)果： 1.第三代BMSCs流式細胞儀檢查CD29

7、、CD45和CD11b的結(jié)果分別為89.82％、3.69％及2.93％；經(jīng)成骨成脂誘導(dǎo)后可以在體外被誘導(dǎo)成為脂肪細胞及成骨細胞。 2.EGFP慢病毒感染BMSCs96小時后熒光顯微鏡下可見EGFP表達，流式細胞儀測定感染率在95％以上。 3.采用鐵濃度為25μg/mL的SPIO—PLL標(biāo)記EGFP—BMSCs后，電鏡及普魯士藍染色可見胞漿內(nèi)大量鐵顆粒，標(biāo)記率為97.9％±1.72，標(biāo)記后細胞存活率為97.8％±0.06，

8、細胞內(nèi)鐵含量為18.38±3.52 pg/cell。SPIO標(biāo)記對EGFP—BMSCs的EGFP表達、增殖、活力、凋亡及多向分化能力均無影響。 4.體外MRI顯示T2*WT序列對標(biāo)記BMSCs的信號變化最敏感，且隨著細胞數(shù)量級增大，信號變化逐漸明顯，顯示信號變化與細胞數(shù)量級間存在相關(guān)性。 5.造模組大鼠血清血清肝功能和肝纖維化生化指標(biāo)均明顯高于正常和對照組大鼠，肝臟切片病理檢查發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)纖維組織增生，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。

9、 6.A組與注射前比較，移植后肝臟SNR明顯降低，此后逐漸升高，至15天與移植前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.748>0.05）；B組注射后肝臟信號亦明顯減低，但信號恢復(fù)較快，至移植后第3天，SNR值與移植前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.117>0.05）；C組與移植前比較，移植后各時間點SNR值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。三組間比較時間因素和分組的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義（F=27.162，P=0.000<0.05）。 7.細胞移植后2

10、4小時，肝、肺內(nèi)可見EGFP熒光，EGFP免疫組化及鐵染色可見大量移植細胞位于肝臟間質(zhì)內(nèi)，肺及腎臟也可見到移植細胞分布：細胞移植后7天，肝內(nèi)可見EGFP熒光，但呈黃綠色，肺內(nèi)EGFP熒光細胞明顯減少，EGFP免疫組化及鐵染色可見移植細胞仍主要位于肝臟間質(zhì)內(nèi)，肺及腎臟此時較少見到移植細胞；細胞移植后15天及6周，肝內(nèi)可見EGFP熒光，鐵染色可見肝臟內(nèi)含鐵細胞數(shù)量隨時間進一步減少，肝小葉中發(fā)現(xiàn)了不含鐵的EGFP免疫組化陽性細胞。 8

11、.細胞移植后24小時六種器官/組織中均有移植細胞分布，到移植后7天，各器官/組織中移植細胞較移植后24小時均有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；至移植后15天，各器官/組織中移植細胞數(shù)較移植后7天從數(shù)值上看有所下降，但只有肌肉組織內(nèi)移植細胞數(shù)的減少有統(tǒng)計學(xué)差異；至移植后42天，各器官/組織中移植細胞數(shù)較移植后15天從數(shù)值上看有所下降，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 1.SPIO—PLL標(biāo)記及EGFP慢病毒感染雙標(biāo)記

12、BMSCs效率高，對細胞生物學(xué)特性無影響，可以用于BMSCs的示蹤研究。 2.體外MR發(fā)現(xiàn)T2*WI序列對信號變化最為敏感，并且信號變化程度與細胞數(shù)量級間存在相關(guān)性。 3.磁標(biāo)記BMSCs經(jīng)盲腸靜脈途徑移植入肝纖維化模型大鼠體內(nèi)后，1.5T臨床MRI系統(tǒng)可以在一定時段內(nèi)對其進行監(jiān)測，但仍不能滿足長期監(jiān)測的要求，尚需進一步研究。含鐵細胞隨時間進程逐漸減少是MR越來越不敏感的原因。 4.EGFP基因標(biāo)記的BMSCs在

13、移植后可以用來進行細胞的追蹤，示蹤時間較MRI更長，但需要進行冰凍切片的熒光觀察或EGFP的免疫組織化學(xué)病理學(xué)檢查。 5.經(jīng)過門靜脈移植BMSCs后，于15天及6周在肝小葉內(nèi)發(fā)現(xiàn)不含鐵的EGFP的免疫組化陽性細胞，可能是在體內(nèi)分化、增殖的移植細胞，并且已經(jīng)遷移到肝實質(zhì)當(dāng)中。 6.經(jīng)過門靜脈移植BMSCs后，移植細胞并不全部分布于肝臟，在其他器官/組織中也有分布。但至移植后7天，肝外器官/組織中的移植細胞數(shù)會明顯減少。肝內(nèi)