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文檔簡介
1、背景: 利用干細胞(stem cell,SC)治療各種組織壞損或退化性疾病是我國“十五”、“十一五”期間的科技主攻方向之一,也是國際上的研究熱點,美國《科學》雜志將干細胞研究評為1999年世界十大科學成就之榜首。骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells,MSCs)是干細胞最重要的一種,它具有多項分化的特點,可分化為其他類型組織細胞,且來源相對廣泛,不涉及倫理問題,因此MSCs在神經、心臟、肝臟等諸多器官疾病
2、方面的應用潛能受到越來越多的重視。 在肝臟疾病方面,Lee K D等用肝細胞生長因子與致瘤素M通過兩步法在體外有效地誘導MSCs向肝細胞分化,4周后,被誘導的細胞在形態(tài)和分子標記物上都具有肝細胞特征。Terai等將綠色熒光蛋白標記的骨髓細胞從尾靜脈注入到四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化小鼠體內,結果提示:在肝損傷微環(huán)境下骨髓細胞可以體內轉化成肝細胞。國內北京軍區(qū)總醫(yī)院首先將自體骨髓干細胞用于40余例重型肝炎和肝硬化患者的治療,
3、取得初步的臨床療效。中山三院肝臟疾病研究實驗室在“干細胞修復肝臟工程”的系列研究中,自2003年開始,進行了大量正常成人和30余例肝病患者MSCs的培養(yǎng)并對其各項生物學特性進行了深入的研究,并于2005年試探性地在臨床對25例晚期肝病志愿者開展經肝動脈途徑自體MSCs移植治療,并取得了明確療效:患者總膽紅素水平在移植治療4周內下降者達到73.5%,凝血功能在移植治療4周內好轉者達到84.6%。 然而,令人鼓舞地臨床、實驗結果卻缺
4、乏客觀的MSCs生長分化證據的支持,MSCs在體內的向肝細胞分化的能力和定居、定位情況尚不十分明確,使植入MSCs在肝臟損傷修復中到底發(fā)揮了多大作用難以正確評價。Weissleder于1999年提出分子影像學的概念后,利用分子影像學的方法對移植MSCs進行監(jiān)測成為研究的熱點,本文即是通過多聚賴氨酸(PLL)介導的氧化鐵納米顆粒(SPIO)轉染骨髓間充質干細胞(MSCs),經盲腸靜脈移植入肝纖維化大鼠,利用MR成像技術對其進行活體示蹤,描
5、述其成像特點,并評價PLL-SPIO對干細胞的標記及活體示蹤效果,為進一步研究干細胞活體內增殖、分化提供影像學的支持。 目的: 提取、分離并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs),探討SPIO(商品名Resovist,Schering公司)標記MSCs的方法、濃度,比較不同濃度SPIO的轉染率及對MSCs的生長、增殖的影響,描述SPIO標記的MSCs體外及活體成像特點,并評價PLL-SPIO對干細胞的標記及活體示蹤效果。
6、 方法: 1.分別采用貼壁法和貼壁法+percoll密度離心法獲取MSCs,體外傳代、培養(yǎng)、純化并通過流式細胞儀檢測CD45、CD29、CD44、CD11b,比較2種方法的優(yōu)劣。 2.檢測獲取的:MSCs性能:MTT測定細胞生長曲線,臺盼藍染色檢測細胞活力,Hoechst 33258檢測凋亡。 3.分別采用鐵濃度為25μg/ml及50μ/ml SPIO-PLL標記MSCs,電鏡觀察細胞內鐵顆粒,普魯士藍染色
7、顯示細胞內鐵,分光光度計測量細胞內鐵含量;評價2種濃度SPIO-PLL標記MSCs后,對其生長及增殖的影響(MTT、細胞活力、凋亡)。 4.用鐵濃度為25μg/ml及50μg/ml的SPIO-PLL標記MSCs,對不同數量級的細胞行MR掃描,掃描序列為:SE序列T1WI,快速自旋回波(FSE)序列T2WI,梯度回波序列(GRE)T2*WI。 5.建立慢性肝纖維化大鼠模型,分為A、B、C三組,分別經盲腸靜脈移植標記MSCs
8、(4×106個/2ml)、SPIO2ul(Fe濃度28mg/ml)、未標記MSCs(4×106個/2ml),并于移植前、移植后1小時、24小時及移植后3、5、7、10、12、15天行MR檢查,測量肝臟信噪比(signal-to-noise ratio,SNR),在信號消失后處死大鼠,取肝臟標本行HE及普魯士藍染色。 結果: 1.MSCs接種24h后可見細胞貼壁,先為單個圓形細胞,后伸展為三角形、多角形,并逐漸變成梭形,約
9、7-10天長滿培養(yǎng)皿。用貼壁篩選法獲得的MSCs接種24h后可見大量的造血干細胞懸浮在培養(yǎng)基中,隨著換液及培養(yǎng)時間的延長,造血干細胞被去掉使MSCs得以純化,而用密度梯度離心法獲得的細胞則含有很少的造血干細胞,細胞純化效果好;流式細胞儀檢查表型的結果也顯示密度梯度離心法獲得的細胞較單純貼壁法獲得的MSCs純度高。 2.鐵濃度25ug/ml細胞內鐵含量為10.95±5.13pg/cell,標記MSCs存活率為98.1%±0.04,
10、標記率為97±1%。鐵濃度50ug/ml細胞內鐵含量為14.22±7.41pg/cell,標記MSCs存活率為97.9%±0.04,標記率為100%。兩組間差別無統(tǒng)計學意義,P>0.05。 3.體外MR成像顯示:T2*WT序列對標記MSCs的信號變化最敏感,且隨著細胞數量級增大,信號變化逐漸明顯,顯示信號與細胞數量級間存在相關性。 4.標記MSCs組(A組):與移植前比較,移植后肝臟信號在T1WI、T2WI、T2*WI序
11、列上均明顯降低,以T2*WI最明顯,此后信號降低程度逐漸減弱,SNR值逐漸升高,至15天與移植前相比,差異無統(tǒng)計學意義(t=3.650,P>0.05)。 注射SPIO組(B組):移植后肝臟信號亦明顯減低,但信號恢復較快,至移植后第3天,SNR值與移植前相比差異無統(tǒng)計學意義(t=2.550,P>0.05)。 未標記MSCs組(C組):與移植前比較,移植后各時間點SNR值差異無統(tǒng)計學意義(F=0.871,P>0.05)。
12、 標記MSCs組(A組)、注射SPIO組(B組)與未標記MSCs組(C組)比較差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.693、2.964,P<0.05)。 注射標記MSCs或SPIO與觀察時間之間存在交互作用(F=4.972,P<0.05):標記MSCs組(A組)與注射SPIO組(B組)之間肝臟SNR隨時問變化的差異有統(tǒng)計學意義(F=9.346,P<0.05)。 MSCs移植后肝臟普魯士藍染色可見藍染細胞主要分布在肝小葉間
13、隔,隨時問推移,細胞數逐漸減少,但是部分細胞逐漸由肝小葉間隔遷移至肝實質。 結論: 1、貼壁法+密度梯度離心法是骨髓問充質干細胞分離純化的較好方法,其獲得的MSCs較單純貼壁法純度明顯高。 2、Fe濃度為25ug/ml、50ug/ml的SPIO-PLL標記MSCs,對其分裂、增殖均無影響,標記率分別為97±1%、100%,細胞內鐵含量為10.95±5.13pg/cell、14.22±7.41pg/cell,均可滿
14、足MSCs磁共振示蹤的要求。 3、標記細胞體外成像以T2*WI序列最為敏感,信號與細胞數量級間存在相關性。 4、腹腔注射CCl4和橄欖油混合液(1:5)可以獲得滿意的大鼠肝纖維化模型,且肝纖維化的程度與注射的時間長度直接相關,有利于控制。 5、盲腸靜脈-門靜脈途徑為MSCs肝臟移植的一條較理想入路,操作簡單,出血少,穿刺成功率高,大鼠死亡率低。 6、SPIO-PLL標記MSCs后,利用MR可對其進行短期活
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