骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠肝臟纖維化的實驗研究.pdf

1、目的：⑴探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCS)體外分離純化擴增培養(yǎng)的方法以及慢病毒載體介導增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP)對其進行標記的理想條件；⑵觀察移植的骨髓間充質(zhì)干細胞在肝臟纖維化模型鼠肝內(nèi)的分布,遷移和分化狀況，并從病理以及血清學水平評價移植細胞對肝臟纖維化模型大鼠的治療效果，為臨床

2、自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療肝臟疾病提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　方法：①利用密度梯度離心結(jié)合貼壁生長的方法體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，流式細胞術(shù)對其表面抗原進行鑒定，并用eGFP對其進行標記；②四氯化碳腹腔注射構(gòu)建SD大鼠肝臟纖維化模型；以eGFP標記的正常SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞為細胞來源，通過尾靜脈注射將標記的細胞移植入肝臟纖維化模型大鼠體內(nèi)，對照組注射生理鹽水。③細胞移植后取大鼠肝臟做組織病理學檢查：冰凍切片在熒光

3、顯微鏡下觀察eGFP陽性細胞在肝內(nèi)的分布狀況；石蠟切片行GFP/ALB免疫熒光雙染檢測歸巢細胞在肝內(nèi)的分化；免疫組化檢測α-SMA在肝內(nèi)的表達狀況；⑷同時采集大鼠血液，以全自動生化分析儀和化學發(fā)光法檢測肝功能指標和血清纖維化指標。
　　結(jié)果：⑴體外分離獲得了高純度貼壁生長的大鼠BMSCs，流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示細胞高表達CD44、CD90，而CD34、CD45表達陰性；并用攜帶eGFP報告基因的慢病毒成功對其進行感染，感染率達80

4、％以上。⑵腹腔注射CCL410周后成功構(gòu)建SD大鼠肝臟纖維化模型。⑶BMSCs移植大鼠肝臟中可檢測到eGFP陽性的細胞，主要沿著中央靜脈及匯管區(qū)周圍纖維間隔分布，并逐漸向肝組織內(nèi)部遷移。免疫組化結(jié)果顯示eGFP陽性細胞呈肝細胞樣細胞形態(tài)，且與肝組織相容。免疫熒光雙染法檢測到部分eGFP陽性細胞同時表達白蛋白（ALB）。α-SMA在肝組織的表達明顯減少。⑷BMSCs移植組與模型對照組和生理鹽水組相比，肝功能和血清纖維化指標好轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)