番木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及其對(duì)嗜酸乳桿菌的轉(zhuǎn)化.pdf

1、凝乳酶是廣泛用于干酪制造業(yè)的重要的酶制劑,其產(chǎn)值占全世界酶制劑的15％,其中凝乳效果最好的是小牛皺胃酶。由于世界干酪產(chǎn)量逐年增長(zhǎng),所需凝乳酶數(shù)量也在大幅提高,皺胃酶供不應(yīng)求。同時(shí),歐洲不斷爆發(fā)的動(dòng)物性傳染病,使消費(fèi)者對(duì)來(lái)源于動(dòng)物的凝乳酶產(chǎn)生恐懼心理,還有一些素食主義者也拒絕食用用小牛皺胃酶生產(chǎn)的干酪,所以近年來(lái)各國(guó)都在積極尋找皺胃酶替代品。番木瓜凝乳蛋白酶是一種具有凝乳作用的植物凝乳酶,克隆番木瓜凝乳蛋白酶基因,轉(zhuǎn)化益生菌嗜酸乳桿菌,用

2、于干酪生產(chǎn),對(duì)解決凝乳酶短缺及滿足特殊人群的需要有重要意義,同時(shí)有益于身體健康,也為今后用乳酸菌商業(yè)化生產(chǎn)人們所需蛋白奠定了基礎(chǔ)。本研究以未成熟的番木瓜(CaricapapayaL.)果實(shí)為試材,用Trizol試劑盒提取其總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈,設(shè)計(jì)特異引物,引入SacI和XbaI雙酶切位點(diǎn),優(yōu)化PCR條件,擴(kuò)增出目的條帶,連接到pMD18-Tsimplevector克隆載體,獲得重組載體pMD18T+,經(jīng)測(cè)序并與GenB

3、ank上公布的番木瓜凝乳蛋白酶基因(AJ131996)序列比對(duì),其相似性達(dá)98%。以SacI和XbaI分別雙酶切克隆載體pMD18T+與表達(dá)載體pMG36e,回收目的基因片段和載體片段,連接獲得含有木瓜凝乳蛋白酶基因的重組表達(dá)載體pMG36e+。活化受體菌株嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC4356),優(yōu)化電脈沖轉(zhuǎn)化法參數(shù),轉(zhuǎn)化獲得6個(gè)轉(zhuǎn)化子,經(jīng)酶切和PCR鑒定,重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入嗜酸乳桿菌(L.aci