胰凝乳蛋白酶模擬酶的制備及其磁性固定化研究.pdf

1、模擬酶(artificial enzyme)是一類人工合成的具有特定催化能力的超分子化合物，在催化和環(huán)境穩(wěn)定性等方面顯著高于生物酶。納米磁性粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)是以納米磁性Fe3O4或γ-Fe2O3等為晶核，高分子基質(zhì)或表面活性劑為殼，經(jīng)包被或包埋而形成的一種具有的超順磁性的新型復(fù)合功能材料。本研究以β-環(huán)糊精作為母體材料，在其2位碳原子上引入咪唑制備了具有胰凝乳蛋白酶活性的模擬酶。并通過環(huán)糊精

2、其它位點(C3或C6)的羥基與本實驗室自行合成的磁性納米粒子的羧基共價偶聯(lián)，或經(jīng)油酸修飾后與油酸修飾的納米磁性粒子通過疏水相互作用實現(xiàn)模擬酶的固定化。通過以上兩種方法成功將胰凝乳蛋白模擬酶固定到納米磁性粒子表面，得到具有磁響應(yīng)性且能重復(fù)利用的水分散性模擬酶/磁性納米復(fù)合材料。主要結(jié)果如下：
　　 1.合成了C2位和C6位單對甲苯磺酸酯，再將咪唑基取代單對甲苯磺酸酯，得到不同取代位置的胰凝乳蛋白酶模擬酶，C2位取代咪唑基的模擬酶活

3、性為kcat:3.01×10-3s-，而C6位取代的模擬酶活性為kcat：2.7×10-4s-。選擇C2位取代咪唑基模擬酶進行磁性固定化研究。
　　 2.羧基功能化納米磁性粒子固定化胰凝乳蛋白酶模擬酶的最適條件為：取1mL(5mg/mL)羧基納米磁性粒子水溶液加入到反應(yīng)體系中時，當給酶量為0.1g，固定化溫度為25℃，固定化時間為36h,pH=7.0時，所得羧基納米粒子固定化模擬酶的酶活力最高(kcat:1.98×10-3s-)

4、；油酸化納米磁性粒子固定化的最適條件為：取1mL(10mg/mL)的油酸納米磁性粒子氯仿溶液加入到反應(yīng)體系中時，當給酶量為0.15g,固定化溫度為40℃，固定化時間為36h,pH=7.5時，所得油酸納米磁性粒子固定化模擬酶的酶活力最高(kcat:2.60×10-3S-)。
　　 3.對固定化后的產(chǎn)物進行了表征。透射電子顯微鏡鑒定表明，羧基納米磁性粒子固定化胰凝乳蛋白酶模擬酶分布均勻，粒徑大小為10nm，出現(xiàn)少量集聚；而油酸納米粒

5、子固定化模擬酶呈單分散狀態(tài)，粒徑大小為25nm，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，包覆層結(jié)構(gòu)明顯。紅外光譜證明環(huán)糊精合成的胰凝乳蛋白酶模擬酶成功固定在羧基納米粒子和油酸納米粒子表面。磁性固定化的胰凝乳蛋白酶模擬酶具有良好的磁響應(yīng)性，在永久磁鐵產(chǎn)生的磁場下只需10s便可從溶液中徹底分離。
　　 4.羧基納米粒子固定化模擬酶的最適反應(yīng)溫度為25℃，最適pH值為7.0，重復(fù)使用10次后，酶活力保持為初始酶活力的43％；油酸修飾的納米磁性粒子固定化模擬酶

6、，最適反應(yīng)溫度為40C，最適pH值為7.5，重復(fù)使用10次后，酶活力保持為初始酶活力的82％。經(jīng)酶活性測定，油酸納米固定化酶活性kcat:2.60×10-3s-高于羧基納米粒kcat:1.98×10-3s-；在分散穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性方面，油酸納米粒子固定化模擬酶活性比羧基納米粒子固定化模擬酶活性高，但低于游離酶酶活性Kcat：3.01×10-3s-。羧基納米粒子固定化方法簡單，合成固定化酶周期短，而油酸納米粒子固定化方法復(fù)雜，合成固定化