原核表達醛（糖）還原酶及霍亂毒素類似嵌合蛋白的研究.pdf

1、本論文主要涉及了三個蛋白的基因克隆表達及相關抑制劑篩選的研究，主要包括與糖尿病綜合癥及炎癥相關的醛糖還原酶和醛還原酶，以及一種具有腦靶向作用的多亞基全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白的基因克隆表達和純化，及采用醛糖還原酶和醛還原酶進行抑制劑的篩選，主要得到的結果有以下三種。
　　第一，醛糖還原酶(Aldehyde reductase AKR1B1，EC1.1.1.21)是醛酮還原酶家族成員，是多元醇通路的關鍵限速酶。越來越多的研究發(fā)現，A

2、KR1B1與多種疾病有關，在一系列的炎癥性疾病等中起著關鍵作用，與多種炎癥介質的產生有直接的關系，可作為篩選非甾體抗炎藥物的新靶點。為了篩選相應的酶抑制劑，為藥物開發(fā)及臨床應用提供參考，本研究構建了重組表達質粒pET-22b-AKR1B1-(His)6，將該質粒轉化至Rosetta(DE3)宿主菌中，通過對表達條件的優(yōu)化，確定表達條件為0.175 mMIPTG、14℃、80 rpm誘導14h，重組蛋白以可溶和沉淀兩種形式表達。采用親和純

3、化得到純度為93％的AKR1B1-(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白質進行鑒定，蛋白質序列分析儀測定氨基酸序列片段與目的蛋白序列比對。利用體外酶動學方法測定AKR1B1-(His)6的比活力為(9.4±0.23) U/mg。使用該蛋白建立醛還原酶抑制劑篩選方法，分別測定已上市的13種非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs，NSAIDs)對AKR1B1-(His

4、)6的抑制活性。結果表明，萘普生、雙氯芬酸、氟滅酸、布洛芬等對融合蛋白AKR1B1-(His)6有較強的抑制作用，可與抗糖尿病并發(fā)癥藥物聯合用藥。
　　醛還原酶(Aldehyde reductase AKR1A1，EC1.1.1.2)是醛酮還原酶家族成員，能將有毒醛還原成相應的醇。為研究非甾體抗炎藥對AKR1A1的抑制作用，為非甾體抗炎藥的副作用及臨床應用提供參考，本研究構建了重組表達質粒pET-22b-(His)6-DDDDK-

5、AKR1A1，將該質粒轉化至Rosetta(DE3)宿主菌中，通過對表達條件的優(yōu)化，確定表達條件為0.25 mMIPTG、16℃、80 rpm誘導14h，重組蛋白以可溶形式表達。采用親和純化得到純度為90％的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。重組蛋白用腸激酶特異性剪切，經過Ni-NTA、Sephadex G-75再次純化，得到純度為98％的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白質序列分

6、析對蛋白質進行鑒定。利用體外酶動學方法測定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力為(41.3±0.1)U/mg、AKR1A1比活力為(79.4±0.15) U/mg。奧沙普秦、酮基布洛芬、氟滅酸、托芬那酸等對AKR1A1有很強的抑制作用，為抗炎藥副作用提供參考。
　　為了得到一種具有腦靶向作用的多亞基蛋白質，本研究還使用原核共表達系統(tǒng)，設計表達了一種全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白。分別獲得重組質粒pET-28a-CTB和pET