醛糖還原酶在視神經(jīng)損傷后的表達(dá)和作用.pdf

1、許多眼科疾病均是在視神經(jīng)損傷后發(fā)生了以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RetinalGanglionCell,RGC)不可逆性凋亡或壞死為主的變化,進(jìn)而導(dǎo)致視神經(jīng)傳導(dǎo)通路的中斷。作為中樞神經(jīng)的代表,視神經(jīng)的損傷和再生機(jī)制近年來得到深入而廣泛的研究。視神經(jīng)在損傷后或者在周圍神經(jīng)病變中不能再生是目前臨床上亟待解決的問題之一。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突形成視神經(jīng)后能夠?qū)⑺幸曈X信息傳遞給神經(jīng)中樞,但是在視神經(jīng)損傷后,由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不可逆性死亡造成視神經(jīng)不能

2、再生,進(jìn)而導(dǎo)致視力永久性喪失。醛糖還原酶(AldoseReductase,AR)屬于還原型輔酶II(NicotinamideAdenosineDinucleotidePhosphate-Hependent,NADPH)依賴型醛酮還原酶家族[1]。醛糖還原酶是葡萄糖代謝多元醇通路中的重要限速酶[2]。近來有學(xué)者隨著對于AR功能研究的不斷深入研究發(fā)現(xiàn),無論在高血糖狀態(tài)下還是在血糖正常的情況下,AR在介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子以及化學(xué)信號的傳導(dǎo)過

3、程中都發(fā)揮著重要的作用[3]。本課題研究對象為AR,重點(diǎn)研究AR在視神經(jīng)損傷后隨時(shí)間的變化情況;AR對視神經(jīng)損傷后存活和再生的作用及影響,探討視神經(jīng)損傷后AR的表達(dá)情況及AR對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和再生的影響。本研究由以下兩部分實(shí)驗(yàn)組成:
　　實(shí)驗(yàn)的第一部分是研究AR在小鼠視神經(jīng)損傷后的表達(dá)變化情況。該部分實(shí)驗(yàn)主要是應(yīng)用C57BL/6-AR+/+(野生型)小鼠,建立小鼠視神經(jīng)橫斷(OpticNerveTransaction,ONT

4、)模型[4],野生型小鼠分組后分別進(jìn)行視神經(jīng)橫斷損傷的手術(shù)及僅分離暴露視神經(jīng)眶內(nèi)段的假手術(shù)處理,分別選取小鼠視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后0d、3d、5d、7d、14d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn),取材收集視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織提取物,分別應(yīng)用WesternBlot、QPCR等方法檢測AR,觀察視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜AR表達(dá)量的變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)的第二部分是研究AR對小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用及AR對小鼠視神經(jīng)

5、橫斷損傷后再生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。首先用AR-/-小鼠與YFP小鼠交配,鑒定獲得AR-/--Thy1-YFP(AR-/-YFP)小鼠。同實(shí)驗(yàn)一的方法,建立Thy1-YFP/AR+/+(AR+/+YFP小鼠)小鼠和Thy1-YFP/AR-/-小鼠(AR-/-YFP小鼠)視神經(jīng)橫斷損傷的模型,分別選取視神經(jīng)橫斷損傷術(shù)后3d、7d、14d等三個(gè)時(shí)間點(diǎn),取材收集兩組對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的眼球組織,應(yīng)用視網(wǎng)膜冰凍切片技術(shù),熒光顯微鏡下分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后3

6、d、7d、14d存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。其次,同樣建立C57BL/6-AR+/+(野生型)小鼠和C57BL/6-AR-/-(AR基因敲除)小鼠視神經(jīng)橫斷模型,分別選取兩組視神經(jīng)損傷術(shù)后3d、7d、14d等三個(gè)時(shí)間點(diǎn),取材收集對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的眼球組織進(jìn)行石蠟切片及蘇木精-伊紅染色(HE染色),分別觀察兩組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞情況。最后利用野生型小鼠和AR基因敲除建立小鼠視神經(jīng)橫斷模型,分別選取兩組視神經(jīng)損傷術(shù)后0d、3d、5d、7d、

7、14d等五個(gè)時(shí)間點(diǎn),取材收集對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織,利用WesternBlot的方法分別檢測兩組神經(jīng)生長相關(guān)蛋白(Growth-associatedprotein-43,GAP-43)的表達(dá)變化情況。
　　通過以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)第一部分實(shí)驗(yàn)中通過WesternBlot方法檢測小鼠視神經(jīng)橫斷組及假手術(shù)組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜AR表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示:假手術(shù)組AR的表達(dá)量并未隨著損傷時(shí)間的增加而發(fā)生明顯的變化,而視神經(jīng)橫斷

8、組的AR表達(dá)量隨著損傷時(shí)間逐漸升高,并在損傷后第7d達(dá)到高峰,并且QPCR結(jié)果與其結(jié)果趨勢一致。實(shí)驗(yàn)第二部分中,AR+/+YFP小鼠和AR-/-YFP小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后,通過視網(wǎng)膜冰凍切片,熒光顯微鏡下分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。AR-/-和野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后,通過HE染色分別觀察計(jì)數(shù)兩組術(shù)后對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果顯示:隨著損傷時(shí)間的增加,兩組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

9、數(shù)目都逐漸的減少,在損傷后3天,野生型小鼠組和AR敲除小鼠的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化;但從損傷后的第7天開始,AR敲除小鼠組存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯多于野生型小鼠組。AR-/-和野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷手術(shù)后,通過WesternBlot方法分別檢測術(shù)后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活情況及視網(wǎng)膜GAP-43表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示:隨著損傷時(shí)間的增加,GAP-43的表達(dá)量逐漸升高,術(shù)后第7d達(dá)到高峰,并且AR基因敲除小鼠組與野生型小鼠組在損傷后

10、的同一時(shí)間點(diǎn),對比觀察到從損傷后第7d開始AR基因敲除小鼠組的GAP-43表達(dá)量明顯高于野生型小鼠組。
　　通過上述研究我們發(fā)現(xiàn):野生型小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后隨著損傷時(shí)間AR表達(dá)量逐漸升高,說明AR參與了視神經(jīng)損傷后的反應(yīng)過程;AR-/-YFP小鼠存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目在術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)明顯多于AR+/+YFP小鼠,提示AR可能參與調(diào)節(jié)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活過程;AR-/-小鼠視神經(jīng)橫斷損傷后GAP-43表達(dá)量在術(shù)后第7d升高