缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血-再灌注腸粘膜損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及醛糖還原酶的作用.pdf

1、腸缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是外科實踐中常見的組織器官損傷之一，在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、心衰以及腸梗阻、小腸移植術(shù)等疾病的病理生理演變過程中起重要作用，它不僅引起腸道局部損害，還導(dǎo)致腸外器官的損傷，甚至多器官功能不全。
　　 基于雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用。目前，尚無采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法探討I

2、PC抗大鼠腸I/R損傷腸黏膜差異表達(dá)蛋白的報道。因此，本實驗擬采用阻斷與開放大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)所致的腸I/R腸黏膜損傷的模型，從以下三部分進(jìn)行研究：1、復(fù)制大鼠腸I/R腸黏膜損傷模型，并確立有效的IPC保護(hù)策略，為下一步蛋白組學(xué)研究作準(zhǔn)備；2、采用2-DE分離腸黏膜差異表達(dá)的蛋白，然后采用質(zhì)譜法鑒定這些蛋白，最后采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcripti

3、on Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)或Western blot技術(shù)選擇驗證有意義的差異表達(dá)蛋白；3、選擇某一個驗證過的差異表達(dá)蛋白，采用其抑制劑來進(jìn)一步研究它與IPC抗大鼠腸I/R腸黏膜損傷的關(guān)系，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分缺血預(yù)處理對大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用
　　 目的：
　　 1.建立大鼠腸I/R腸黏膜損傷的模型。
　　 2.證實有效的抗大鼠腸I/R

4、腸黏膜損傷的IPC策略。
　　 3.為下一步蛋白組學(xué)研究作準(zhǔn)備。
　　 結(jié)論：
　　 1.腸系膜上動脈阻斷60min，開放60min可致大鼠小腸黏膜損傷，提示腸I/R腸黏膜損傷模型能被穩(wěn)定復(fù)制。
　　 2.腸系膜上動脈阻斷10min，開放10min，一個循環(huán)的IPC策略對大鼠腸I/R腸黏膜損傷有保護(hù)作用，提示本研究中IPC策略是有效的。
　　 第二部分
　　 缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注

5、腸粘膜損傷的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：
　　 1.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離、鑒定IPC抗腸I/R腸黏膜損傷的腸黏膜差異表達(dá)蛋白。
　　 2.采用RT-PCR或Western blot方法進(jìn)一步驗證有意義的差異蛋白的表達(dá)。
　　 3.初步探討IPC可能的腸保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.動物模型
　　 成年雄性SD大鼠20％烏拉坦0.6ml/100mg腹腔注射后仰臥固定于手術(shù)臺，

6、常規(guī)消毒，經(jīng)腹正中切口，分離SMA，微動脈夾夾閉，縫合切口。60min后經(jīng)原切口進(jìn)腹，取出動脈夾，恢復(fù)血供，60min后取標(biāo)本。
　　 2.IPC策略
　　 在長時間阻斷SMA之前，先用動脈夾夾閉SMA10min，再松開10min，一個循環(huán)。
　　 3.實驗分組
　　 24只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：
　　 Control組：只分離SMA120min。
　　 Injury組：分離SMA

7、，微動脈夾夾閉，縫合切口。60min后經(jīng)原切口進(jìn)腹，取出動脈夾，恢復(fù)血供，60min后取標(biāo)本。
　　 IPC組：在長時間阻斷SMA之前，先用動脈夾夾閉SMA10min，再松開10min，余同Injury組。
　　 4.觀察指標(biāo)
　　 4.1小腸黏膜組織差異表達(dá)蛋白：采用2-DE方法分離腸黏膜組織差異表達(dá)的蛋白；采用質(zhì)譜法鑒定上述差異表達(dá)的蛋白。
　　 4.2RT-PCR驗證：分析所有鑒定的差異表達(dá)的蛋白，

8、對有意義的(與腸I/R損傷有關(guān))蛋白采用RT-PCR方法驗證，觀察其是否在小腸黏膜組織有表達(dá)。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有計量數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理。多組均數(shù)比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。2-DE分析采用ImageMaster2DElite5.0軟件。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.小腸黏膜組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 Co

9、ntrol組、Injury組和IPC組分別有(1287±20)、(1404±20)和(1338±20)個蛋白質(zhì)點得到分離，Control組和Injury組組間比較有16個差異表達(dá)的蛋白，Injury組和IPC組組間比較有14個差異表達(dá)的蛋白。經(jīng)分析文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)醛糖還原酶、醛脫氫酶、順烏頭酸酶等蛋白涉及抗氧化、抑制凋亡和改善能量代謝等功能，而這些功能與腸I/R損傷的機(jī)制有關(guān)。
　　 2.腸I/R和腸IPC對腸I/R后腸黏膜醛糖還原

10、酶mRNA表達(dá)的影響
　　 通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)發(fā)現(xiàn)醛糖還原酶與IPC的心肌保護(hù)作用有關(guān)，因此推測它也可能與IPC的腸黏膜保護(hù)作用有關(guān)。故本研究中對其在腸黏膜的表達(dá)進(jìn)行了驗證。Injury組和IPC組的腸黏膜醛糖還原酶mRNA的表達(dá)均顯著小于Control組(P＜0.01)，而IPC組顯著高于Injury組(P＜0.05)，與2-DE的結(jié)果一致。提示I/R能下調(diào)醛糖還原酶的mRNA表達(dá)，而IPC可上調(diào)其表達(dá)。
　　 結(jié)論：

11、>　　 1.蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示IPC的腸保護(hù)機(jī)制可能與其上調(diào)醛糖還原酶、醛脫氫酶、順烏頭酸酶等一些具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡及改善能量代謝的蛋白有關(guān)。
　　 2.腸I/R下調(diào)腸黏膜醛糖還原酶mRNA的表達(dá)，IPC能減輕腸I/R導(dǎo)致的腸黏膜醛糖還原酶mRNA表達(dá)的下調(diào)，提示醛糖還原酶可能介導(dǎo)IPC抗腸I/R腸黏膜損傷。
　　 第三部分醛糖還原酶在缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸粘膜損傷中的作用
　　 目的：

12、　　 1.在第二部分研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實醛糖還原酶在缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷中的作用。
　　 2.初步探討醛糖還原酶介導(dǎo)缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.小腸組織光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)及改良的Chiu's評分變化
　　 光鏡下可見Control組腸黏膜完整，Injury組和Epalrestat組損傷嚴(yán)重，IPC組和DMSO組損傷輕微。IPC組小

13、腸改良的Chiu's評分和DMSO組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.小腸黏膜組織LD含量的變化
　　 IPC組小腸黏膜LD與DMSO組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury

14、組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組問無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.小腸黏膜MDA含量的變化
　　 IPC組小腸黏膜MDA含量和DMSO組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.小腸黏膜組織MPO活性的變化
　

15、　 IPC組小腸黏膜MPO活性和DMSO組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.醛糖還原酶介導(dǎo)缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用。
　　 2.醛糖還原酶在缺血預(yù)處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷中的作用與抑制腸黏膜氧