醛酮還原酶AKR1C2原核表達及其應用.pdf

1、醛酮還原酶AKR1C2是一種腫瘤基因相關蛋白，正常組織含量極少，當癌癥發(fā)生時，AKR1C2含量升高，因此醛酮還原酶AKR1C2在生物體內的表達、超表達，可作為長期反應癌癥發(fā)展水平的一項標準，是監(jiān)測癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要指標。通過免疫學手段，建立起的針對醛酮還原酶AKR1C2的檢測方法，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供了新的研究方向。
　　本文利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達醛酮還原酶AKR1C2基因。構建表達載體pET-15b-AKR1C2并轉化

2、至大腸桿菌 BL21感受態(tài)細胞。之后對其進行表達，對表達產物進行 SDS-PAGE檢測，實驗組出現(xiàn)一條大約37kD條帶。優(yōu)化可溶性目的蛋白表達條件，選擇誘導時間10 h、誘導溫度20℃、誘導劑濃度0.8 mM、轉接量1:30作為最適蛋白表達條件，蛋白含量由未經優(yōu)化前的5.45 mg/mL提高到9.50 mg/mL。優(yōu)化作用明顯，提高了可溶性目的蛋白表達量。在最優(yōu)表達條件下表達蛋白并進行純化，得到目的蛋白單一條帶，雜蛋白被除去，純度在98

3、％以上。用獲得目的蛋白分別免疫新西蘭大耳兔和BALB/c小鼠，獲取兔源和鼠源的AKR1C2抗體，測定效價約為1:60000,并建立雙抗夾心的AKR1C2測定方法。通過對其酶活力進行測定，醛酮還原酶AKR1C2對體內激素類羰基化合物甲睪酮、孕酮的催化活性較低，對外源化合物苯甲醛、對苯醌有中等的催化活性，對丙二醛、丁烯醛、甘油醛有較高的催化活性。選擇甘油醛作為 AKR1C2最適底物，摸索最佳催化條件，當酶含量為0.5 mg，底物濃度為1.0