醛糖還原酶(AR)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞(HMC)表達(dá)Fibronextin的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、腎小球硬化是各種原因所致腎小球損傷和病變的共同結(jié)局,是由多種生物活性物質(zhì)和多種細(xì)胞成分參與的一個(gè)復(fù)雜病理過(guò)程,其主要的病理特征之一是腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)的異常沉積。研究認(rèn)為ECM合成和(或)降解失衡是腎小球硬化發(fā)生的重要機(jī)制之一,而系膜細(xì)胞(Mesangial Cell,MsC)增生則是許多腎小球疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的中心環(huán)節(jié),并且在腎小球內(nèi)ECM代謝及調(diào)控過(guò)程中起重要作用,體內(nèi)外各種生長(zhǎng)

2、因子和細(xì)胞因子均可刺激MsC增殖。因此,研究腎小球系膜細(xì)胞與腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展之間的相互關(guān)系也是近年來(lái)器官纖維化研究領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一。
　　 MsC是腎小球內(nèi)固有的一種血管外周細(xì)胞,大量研究證實(shí),該細(xì)胞可自分泌多種細(xì)胞因子:如血小板源生長(zhǎng)因子、IL-6、TGF-β1、內(nèi)皮素1等,后者可促進(jìn)MsC自身分裂、增生及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌,在腎小球硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究已證實(shí),腎臟MsC高表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(tran

3、sforming growth factorβ1,TGF-β1),TGF-β1是一個(gè)多功能細(xì)胞因子,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞凋亡等功能。TGF-β1具有調(diào)節(jié)ECM合成、代謝過(guò)程的作用,可以直接促進(jìn)ECM成分的合成或影響ECM合成和(或)降解主要調(diào)節(jié)酶系統(tǒng)的活性而促進(jìn)ECM合成增加和沉積,從而在腎小球硬化發(fā)生與發(fā)展的病理過(guò)程中具有重要的作用。
　　 醛糖還原酶(Aldose Reductase,AR)為NADPH依賴性醛-酮

4、還原酶家族成員之一,是多元醇代謝通路中的限速酶,可催化己糖或戊糖的NADPH依賴性還原反應(yīng),使之變成相應(yīng)的糖醇或多元醇。AR廣泛分布于神經(jīng)、肌肉、腦、腎臟、胎盤(pán)、血管、視網(wǎng)膜等組織中,在不同組織中的分子構(gòu)成、免疫原性及其他理化性質(zhì)有差別。對(duì)AR的研究,以往都集中在糖尿病及其并發(fā)癥中,但新近的研究發(fā)現(xiàn),AR的某些功能和高糖環(huán)境并不相關(guān)。我們課題組前期通過(guò)SSH-PCR研究發(fā)現(xiàn),AR是大鼠MsC中TGF-β1相關(guān)反應(yīng)性基因之一,而TGF-β

5、1在組織纖維化,特別是腎臟纖維化中起著重要作用,因此AR是否參與了TGF-β1在非高糖狀態(tài)下所導(dǎo)致的腎小球硬化、腎臟纖維化及其病理過(guò)程值得深入研究。
　　 纖連蛋白(Fibronectin,FN)是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的一個(gè)重要組成部分,是一種大分子糖蛋白,在正常組織中分布廣泛,具有促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)、分化、調(diào)理吞噬等功能,在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用中起著重要作用。FN可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生,產(chǎn)生膠原纖維,促進(jìn)纖維化的形成,研究發(fā)現(xiàn)F

6、N的合成及降解的異常在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起很大的作用。
　　 本課題采用細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、免疫熒光、RNA干擾、RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot等實(shí)驗(yàn)方法,觀察AR在人系膜細(xì)胞中的表達(dá)及其與TGF-β1的相互關(guān)系,觀察AR在TGF-β誘導(dǎo)Fibronectin表達(dá)增高過(guò)程中的作用,并初步探討這種作用所涉及的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等作用機(jī)制,以明確AR在腎小球硬化等病理過(guò)程中的作用及意義,進(jìn)一步認(rèn)

7、識(shí)和了解AR在非糖尿病性腎臟疾病(主要為腎小球腎炎、纖維化和硬化)中的新作用,以期能夠?yàn)槟I小球硬化發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分TGF-β1對(duì)人系膜細(xì)胞表達(dá)AR、FN以及MAPKs信號(hào)通路的影響
　　 目的：探討外源性TGF-β1對(duì)體外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞(HMC)表達(dá)AR、FN以及對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,在培養(yǎng)液中添加外源性TGF-β1因子,采用免疫熒光和We

8、stern Blot方法觀察HMC內(nèi)AR、FN和MAPKs表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：以不同濃度TGF-β1(1-10ng/ml)刺激HMC24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR和FN表達(dá)均增高,其中以1ng/mlTGF-β1作用濃度下AR、FN表達(dá)升高最為明顯(P＜0.05);再以1ng/mlTGF-β1以不同的作用時(shí)間(0-4h)刺激HMC,可見(jiàn)AR、FN在15min時(shí)表達(dá)即開(kāi)始增高,其中AR表達(dá)在TGF-β1作用后1h升高最明顯(P＜0.05

9、),FN在2h升高最明顯(P＜0.05)。與此同時(shí),TGF-β1激活了MAPKs信號(hào)通路,TGF-β1作用15min后可見(jiàn)磷酸化的ERK、INK和p38表達(dá)升高,其中磷酸化的ERK、INK在作用后30min達(dá)高峰,磷酸化的p38在1h后達(dá)高峰(P＜0.05),然后逐漸下降;磷酸化的ERK表達(dá)量和持續(xù)時(shí)間明顯多于磷酸化JNK和p38。
　　 小結(jié)：外源性TGF-β1可上調(diào)HMC內(nèi)AR、FN的表達(dá);TGF-β1可以活化MAPKs信號(hào)

10、通路,其中以ERK信號(hào)通路活化效果最明顯,提示TGF-β1上調(diào)AR、FN的表達(dá)可能與激活MAPKs信號(hào)通路有關(guān),ERK信號(hào)通路在這過(guò)程中可能起著主要的作用。TGF-β1可調(diào)節(jié)AR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了在HMC內(nèi),AR也是TGF-β1的反應(yīng)性基因。
　　 第二部分抑制AR活性,阻斷MAPKs和PKC信號(hào)通路對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)FN表達(dá)的影響
　　 目的：探討AR抑制劑Zopolrestat和Sorbinil,MAPKs信號(hào)通

11、路抑制劑U0126(ERK抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)和G(o)6983(PKC抑制劑)對(duì)體外培養(yǎng)的HMC使用TGF-β1誘導(dǎo)FN表達(dá)的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,通過(guò)預(yù)先在培養(yǎng)液中分別添加AR抑制劑Zopolrestat和Sorbinil,MAPKs信號(hào)通路抑制劑U0126、SB203580、SP600125和PKC信號(hào)通路抑制劑G(o)6983作用后,再用外源性TGF-β1

12、因子刺激,采用WesternBlot方法觀察HMC內(nèi)FN表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：僅使用AR抑制劑Zopolrestat和Sorbirtil作用于HMC,與未使用AR抑制劑的HMC相比,FN的表達(dá)未見(jiàn)減少;但在使用Zopolrestat和Sorbinil預(yù)孵育HMC后,再用TGF-β1刺激,則可發(fā)現(xiàn)FN的表達(dá)明顯減少(P＜0.05),使用Zopolrestat預(yù)作用組FN的表達(dá)比單獨(dú)使用TGF-β1刺激時(shí)減少了2.9倍,使用So

13、rbinil預(yù)作用組的FN的表達(dá)減少了2.5倍:分別以不同濃度的ERK、p38、JNK和PKC信號(hào)通路抑制劑作用于HMC,與正常對(duì)照組相比,FN的表達(dá)未見(jiàn)減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在預(yù)先使用ERK、p38、JNK和PKC抑制劑作用于細(xì)胞后,再用外源性TGF-β1刺激,則發(fā)現(xiàn)FN的表達(dá)明顯減少(P＜0.05),ERK、p38、JNK和PKC抑制劑預(yù)作用HMC組中的FN表達(dá)分別減少了2倍、1.6倍、1.8倍和2.4倍;預(yù)先使用Zopolrest

14、at孵育,再用ERK、p38、JNK和PKC通路抑制劑作用,最后使用TGF-β1刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK、JNK和PKC抑制劑使FN的表達(dá)分別減少2.3倍、2.4倍和2.1倍(P＜0.05)。但AR抑制劑和p38通路抑制劑合用后,與對(duì)照組比較,FN的表達(dá)未減少。
　　 小結(jié)：在無(wú)TGF-β1刺激時(shí),單獨(dú)使用AR抑制劑(Zopolrestat和Sorbinil),或者單獨(dú)使用MAPKs和PKC信號(hào)通路抑制劑并不能減少HMC內(nèi)FN的表達(dá)

15、,但在使用AR抑制劑,或者ERK、JNK、p38和PKC信號(hào)通路抑制劑預(yù)作用HMC后,再以TGF-β1刺激時(shí),則能明顯減少細(xì)胞內(nèi)FN的表達(dá)。說(shuō)明AR、ERK、JNK、p38和PKC信號(hào)通路參與了TGF-β1誘導(dǎo)的FN表達(dá)過(guò)程的調(diào)控。以AR抑制劑和ERK、JNK和PKC通路抑制劑共同預(yù)作用HMC后,FN的表達(dá)明顯減少,尤其是ERK和JNK通路更加明顯,證明AR,ERK和JNK通路對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)FN的表達(dá)過(guò)程可能存在疊加作用,也初步證明

16、AR對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)FN的表達(dá)過(guò)程的調(diào)控作用可能通過(guò)ERK、JNK和PKC通路實(shí)現(xiàn)的。AR抑制劑和p38信號(hào)通路抑制劑共同作用后,TGF-β1誘導(dǎo)FN的表達(dá)并未減少,推測(cè)其原因可能為AR對(duì)HMC的作用與p38信號(hào)通路的作用相互拮抗,但具體機(jī)制不清楚,有待進(jìn)一步研究。提示在HMC內(nèi)TGF-β1誘導(dǎo)的MAPKs信號(hào)通路活化過(guò)程中,ERK、JNK與p38信號(hào)通路的作用存在著一定的差異。同時(shí)AR抑制劑必須在TGF-β1刺激的情況下才能發(fā)揮對(duì)F

17、N表達(dá)的調(diào)控作用,也更進(jìn)一步的證明了在HMC中AR為T(mén)GF-β1的反應(yīng)性基因。
　　 第三部分醛糖還原酶基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)FN的表達(dá)及對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響
　　 目的：進(jìn)一步證明醛糖還原酶基因在TGF-β1誘導(dǎo)的FN表達(dá)過(guò)程中的作用及對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-AR至HMC內(nèi)及用RNA干擾技術(shù)干擾HMC內(nèi)AR基因表達(dá),觀察HMC表達(dá)AR、FN以及MAPKs

18、通路變化情況;轉(zhuǎn)染和干擾AR基因后的細(xì)胞預(yù)先使用MAPKs、PKC信號(hào)通路抑制劑作用,再用外源性TGF-β1刺激;采用免疫熒光、Western Blot、RT-PCR、Real-Time PCR方法觀察HMC內(nèi)AR、FN和MAPKs信號(hào)通路的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功轉(zhuǎn)染和干擾HMC內(nèi)AR基因,并經(jīng)多種方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染和干擾效果明顯。轉(zhuǎn)染AR基因后,與正常對(duì)照相比,HMC內(nèi)AR蛋白表達(dá)增高了4.3倍,FN蛋白表達(dá)增高2.5倍(P＜

19、0.05);轉(zhuǎn)染AR基因的HMC再經(jīng)TGF-β1刺激后,FN表達(dá)增加更為明顯(為對(duì)照組的3.6倍,P＜0.05);RNA干擾AR基因后,HMC中AR和FN表達(dá)明顯減少(P＜0.05),干擾后AR表達(dá)在蛋白水平減少了6.8倍,FN表達(dá)減少了16.2倍(P＜0.05);RNA干擾后的HMC再用TGF-β1刺激,與對(duì)照組比較,FN的表達(dá)減少8.1倍(P＜0.05),和單純干擾組比較有所上升,但卻明顯低于未干擾組;轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-AR后,

20、使用免疫熒光方法檢測(cè),與正常對(duì)照組比較,系膜細(xì)胞內(nèi)AR和FN熒光表達(dá)明顯增強(qiáng);通過(guò)RT-PCR、Real-TimePCR驗(yàn)證,AR在mRNA水平增多與對(duì)照組相比超過(guò)10倍以上。在AR轉(zhuǎn)染組HMC中使用MAPKs、PKC信號(hào)通路抑制劑預(yù)孵育后,再用TGF-β1刺激,發(fā)現(xiàn)FN表達(dá)減少(P＜0.05),但與未轉(zhuǎn)染AR基因的細(xì)胞相比,FN減少的程度明顯降低,說(shuō)明AR活性增高對(duì)MAPKs、PKC信號(hào)通路活性有一定的影響。在使用RNA干擾AR基因后

21、的系膜細(xì)胞用免疫熒光檢測(cè),與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞內(nèi)AR和FN熒光表達(dá)明顯減弱,通過(guò)RT-PCR、Real-TimePCR驗(yàn)證,AR在mRNA水平與對(duì)照組相比減少超過(guò)了80％;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)在RNA干擾AR基因的細(xì)胞,預(yù)先使用MAPKs、PKC通路抑制劑孵育后,再用TGF-β1刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN表達(dá)明顯減少(P＜0.05),與未受RNA干擾的細(xì)胞相比,FN表達(dá)減少的程度明顯加重,且干擾后MAPKs信號(hào)通路的磷酸化水平明顯受到抑制,包括磷酸化的

22、ERK、p38和JNK表達(dá)均明顯減少,更進(jìn)一步的證明了AR基因參與了TGF-β1誘導(dǎo)的MAPKs通路的活化過(guò)程。
　　 小結(jié)：轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-AR后,即使在無(wú)TGF-β1刺激的情況下,FN的表達(dá)也明顯增多,TGF-β1刺激后FN的表達(dá)增多更加明顯。用RNA干擾技術(shù)干擾AR基因后,即使無(wú)TGF-β1的刺激,FN的表達(dá)也明顯的減少,說(shuō)明改變HMC內(nèi)AR基因表達(dá)的變化本身可以影響FN表達(dá)。在TGF-β1刺激時(shí),轉(zhuǎn)染和干擾AR基因

23、對(duì)FN表達(dá)具有明顯的影響,進(jìn)一步說(shuō)明了AR參與了TGF-β1誘導(dǎo)的FN的調(diào)控過(guò)程,轉(zhuǎn)染AR基因后用MAPKs、PKC信號(hào)通路抑制劑孵育,再用TGF-β1刺激,與未轉(zhuǎn)染AR基因的細(xì)胞相比,FN減少的程度明顯降低;在RNA干擾AR基因的細(xì)胞,預(yù)先使用MAPKs、PKC通路抑制劑,再用TGF-β1刺激,與未受RNA干擾的細(xì)胞相比,FN表達(dá)減少程度明顯加重,進(jìn)一步的說(shuō)明AR對(duì)MAPKs,PKC信號(hào)通路的活性存在一定的影響;干擾AR基因后,MAP

24、Ks信號(hào)通路的活性也明顯受到抑制,證明了TGF-β1誘導(dǎo)的MAPKs信號(hào)通路的活化過(guò)程與AR的活性狀態(tài)有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.外源性TGF-β1可上調(diào)HMC內(nèi)AR、FN的表達(dá),提示在HMC內(nèi),AR仍然是TGF-β1的下游反應(yīng)性基因之一,這也進(jìn)一步證明了課題組前期研究結(jié)果。TGF-β1在增加AR、FN表達(dá)的同時(shí)激活了包括ERK、p38和JNK信號(hào)通路,其中ERK信號(hào)通路活化效果最明顯,說(shuō)明TGF-β1對(duì)人系膜細(xì)胞內(nèi)

25、FN的表達(dá)的調(diào)控作用,可能與TGF-β1刺激活化了ERK、p38和JNK信號(hào)通路有關(guān),ERK信號(hào)通路可能起著重要作用。
　　 2.在無(wú)外源性TGF-β1刺激的情況下,單獨(dú)使用AR抑制劑或者單獨(dú)使用MAPKs和PKC信號(hào)通路抑制劑并不能減少HMC內(nèi)FN的表達(dá)。但在TGF-β1刺激下,AR抑制劑、MAPKs和PKC信號(hào)通路抑制劑能明顯的減少HMC內(nèi)FN的表達(dá),說(shuō)明AR參與了TGF-β1誘導(dǎo)FN高表達(dá)的調(diào)控過(guò)程,且這一過(guò)程可能與MAP

26、Ks和PKC信號(hào)通路有關(guān)。AR抑制劑必須在TGF-β1刺激的情況下才能發(fā)揮對(duì)FN表達(dá)的調(diào)控作用,也更進(jìn)一步的證明了AR為T(mén)GF-β1的反應(yīng)性基因。
　　 3.轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-AR后,即使在無(wú)TGF-β1刺激的情況下,FN的表達(dá)也明顯增多,添加TGF-β1刺激后FN的表達(dá)增多更加明顯。用RNA干擾AR基因后,在無(wú)TGF-β1刺激的情況下,FN的表達(dá)也明顯的減少,說(shuō)明AR本身也參與了HMC內(nèi)FN的表達(dá)調(diào)控作用。在TGF-β1刺

27、激時(shí),轉(zhuǎn)染和干擾AR基因?qū)N表達(dá)有更加明顯的影響,轉(zhuǎn)染后使FN的表達(dá)增多更明顯,干擾后FN的表達(dá)減少也更顯著,進(jìn)一步說(shuō)明了AR參與了TGF-β1誘導(dǎo)的FN的調(diào)控過(guò)程。在轉(zhuǎn)染AR基因后的細(xì)胞,用MAPKs和PKC信號(hào)通路抑制劑作用,FN的減少程度不如未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,進(jìn)一步的說(shuō)明AR對(duì)MAPKs,PKC信號(hào)通路的活性存在一定的影響,高表達(dá)AR能夠削弱通路抑制劑對(duì)信號(hào)通路的抑制作用;干擾AR基因后,MAPKs信號(hào)通路的活性也明顯受到抑制,證明