纈沙坦對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-Β和P38MAPK表達(dá)的影響.pdf

1、目的:探討纈沙坦(valsartan,Val)對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(Rat mesangial cells,HBZY-1)增殖作用、氧化應(yīng)激作用及對(duì)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)及其上游因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1(transforming growth factorbetal,TGF-β1)的影響,進(jìn)一步闡明纈沙坦的腎臟保護(hù)機(jī)制。
　　

2、方法:
　　 1.培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞于37℃,5％C02的恒溫孵育箱中,培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基,取第3～5代用于實(shí)驗(yàn)(從液氮中復(fù)蘇未知代數(shù)細(xì)胞,定為第一代)。
　　 2.將體外培養(yǎng)的HBZY-1細(xì)胞分成正常組(N組,含5.5mmol/L葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組(H組,含30mmol/L葡萄糖)、甘露醇對(duì)照組(M組,含5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露酵)、高糖+纈沙坦組(V組,以10

3、0μmol/L、10μmol/L、1μmol/L三種濃度纈沙坦分別命名為HV組,V組,LV組分別干預(yù)24tb時(shí),確定纈沙坦終濃度為10μmol/L)、高糖+p38MAPK阻斷劑SB203580組(B組,以20mol/L、2mol/L、0.2mol/L三種濃度p38MAPK阻斷劑SB203580分別命名為B組,MB組,LB組分別干預(yù)24d,時(shí),確定阻斷劑終濃度為20μmol/L)分別培養(yǎng)。
　　 3.培養(yǎng)24dx時(shí)、48小時(shí)后倒置

4、顯微鏡觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu);四甲基偶氮唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法測(cè)定細(xì)胞存活率、抑制率。
　　 4.生化法分別測(cè)定培養(yǎng)24小時(shí)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮(nitrogen oxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse trans

5、cription polymerase chainreaction,RT-PCR)方法測(cè)定培養(yǎng)24小時(shí)各組p38MAPK、TGF-β1 mRNA水平表達(dá)情況。
　　 5.各組應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry)、和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)測(cè)定培養(yǎng)24小時(shí)各組p38MAPK、TGF-β1蛋白水平表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組細(xì)胞形態(tài)學(xué):24小時(shí),N組的細(xì)胞形態(tài)正

6、常,結(jié)構(gòu)清晰可辨。H組細(xì)胞雜亂無(wú)章,扁平程度最明顯。M組細(xì)胞與N組細(xì)胞形態(tài)相似,細(xì)胞數(shù)量均略增多,胞體略肥大。V組與B組細(xì)胞形態(tài)改變相似,細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不甚清晰,細(xì)胞扁平呈凋亡狀態(tài)。48小時(shí),H組已全部脫離瓶壁懸浮于培養(yǎng)上清中。
　　 2.各組細(xì)胞增殖效應(yīng):24小時(shí),與N組相比,H組細(xì)胞細(xì)胞增殖,OD值增加,細(xì)胞存活率提高,與H組相比,V組和B組細(xì)胞增殖受到抑制,OD值減少,細(xì)胞存活率降低(P均＜0.01)。
　　

7、 3.各組氧化應(yīng)激效應(yīng):與N組相比H組細(xì)胞上清中SOD活性顯著下降,MDA含量明顯升高,NO含量降低(P均＜0.01),與H組相比V組SOD活性升高,NO含量升高,MDA含量下降(P均＜0.01),與H組相比,B組SOD活性升高,MDA的含量下降(P均＜0.01),NO的含量升高(P＜0.05)。
　　 4.各組p38MAPK和TGF-β1 mR-NA表達(dá):與N組相比H組細(xì)胞中p38MAPK、TGFβ1 mRNA及蛋白表達(dá)增加

8、。與H組相比,V組和B組細(xì)胞中p38MAPK、TGF-β1mRNA均表達(dá)減少(P均＜0.01)。
　　 5.各組p38MAPK和TGF-β1蛋白表達(dá):與N組相比H組細(xì)胞中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)增加。與H組相比V組和B組細(xì)胞中p38MAPK、TGF-β1蛋白表達(dá)均減少(P均＜0.01)。
　　 6.p38MAPK蛋白主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。TGFβ1蛋白主要位于細(xì)胞漿,少數(shù)細(xì)胞位于細(xì)胞膜。
　　 結(jié)論