P選擇素L-EGF單抗及N-去硫酸肝素抗胃癌轉(zhuǎn)移機制研究.pdf

1、胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤致死的關(guān)鍵因素。腫瘤轉(zhuǎn)移至今仍缺乏有效的治療方法。近年有關(guān)細胞粘附分子與腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究已越來越被人們所重視。選擇素是新近確定的一類粘附分子家族，其重要成份之一的P選擇素(GMP140/顆粒表面膜蛋白，分子量140KD)主要分布于中等大小血管內(nèi)皮細胞棒狀小體(Weibel-Palade)及血小板a顆粒，并隨這些細胞活化而迅速表達于細胞膜表面或釋放至血液中。有關(guān)研究表明，P選擇素通過介導

2、腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞和血小板之間相互作用，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中可能起粘附介導作用。近年的研究認為，P選擇素的凝集素與表皮生長因子結(jié)構(gòu)域的共同區(qū)域(L-EGF)可能是其粘附更有效的功能域。體外實驗表明P選擇素L-EGF單克隆抗體，可特異性結(jié)合P選擇素，具有抗活化血小板與中性粒細胞粘附的功能。 肝素為高度硫酸化的蛋白多糖，作為抗凝劑，已被廣泛應(yīng)用于臨床。動物實驗發(fā)現(xiàn)肝素可通過阻止P選擇素的粘附介導作用從而抑制實驗性腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，肝素可

3、能具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。然而，由于肝素強烈的抗凝活性，限制了它的臨床應(yīng)用。對肝素進行化學修飾，可降低其抗凝活性，但可增強其抗粘附與抗腫瘤血管形成作用。 本研究用人胃癌組織原位移植SCID小鼠建立胃癌轉(zhuǎn)移模型，觀察P選擇素L-EGF單克隆抗體和N-去硫酸肝素對胃癌轉(zhuǎn)移的影響，旨在探討P選擇素I～-EGF單克隆抗體和N.去硫酸肝素對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機制，為P選擇素L-EGF單克隆抗體和N-去硫酸肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供理論基

4、礎(chǔ)。 本文在建立人胃癌組織原位移植SCID小鼠胃癌轉(zhuǎn)移模型基礎(chǔ)上，研究P選擇素L-EGF單抗對P選擇素表達與胃癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)注射P選擇素L-EGF單抗后小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移率顯著低于生理鹽水對照組。結(jié)果表明，P選擇素L-EGF單抗通過抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞、血小板的粘附，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。熒光定量PCR測定顯示，正常對照鼠胃組織P選擇素mRNA表達較低，SCID小鼠有癌轉(zhuǎn)移者其胃癌組織中P選擇素mRNA表達顯著較不伴癌

5、轉(zhuǎn)移者強，L-EGF單抗組P選擇素mRNA表達較低。表明，P選擇素L-EGF單克隆抗體可通過抑制P選擇素mRNA基因表達而進一步發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移作用。 本文用人胃癌組織原位移植SCID小鼠建立胃癌轉(zhuǎn)移模型，觀察N-去硫酸肝素對胃癌轉(zhuǎn)移的影響，研究N-去硫酸肝素對P選擇素表達、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-去硫酸肝素組轉(zhuǎn)移顯著被抑制。熒光定量PCR測定顯示，SCID小鼠伴有癌轉(zhuǎn)

6、移者其胃癌中P選擇素mRNA表達較不伴癌轉(zhuǎn)移者明顯增強；生理鹽水組P選擇素mRNA表達較正常小鼠胃組織P選擇素mRNA表達明顯增強，N-去硫酸肝素組P選擇素mRNA表達較生理鹽水組低。免疫組化方法檢測腫瘤組織微血管密度(MVD)、VEGF的表達。熒光定量PCR檢測腫瘤組織VEGFmRNA與bFGFmRNA表達。結(jié)果顯示，N-去硫酸肝素組平均微血管密度顯著較生理鹽水組低，生理鹽水組VEGF陽性表達率明顯高于N-去硫酸肝素治療組。熒光定量P

7、CR測定顯示，N-去硫酸肝素組VEGFmRNA與bFGFmRNA表達較生理鹽水組低。N-去硫酸肝素組未出現(xiàn)明顯出血等不良反應(yīng)。結(jié)果表明，N-去硫酸肝素通過抑制腫瘤組織P選擇素表達及VEGF與bFGF表達和血管生成，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。N-去硫酸肝素無明顯出血等不良反應(yīng)。 進一步體外實驗予N-去硫酸肝素處理體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細胞，通過ELISA和實時熒光定量PCR方法檢測胃癌細胞VEGF的表達，研究N-去硫酸肝素對胃癌轉(zhuǎn)

8、移的作用機制。ELISA結(jié)果顯示，與陰性對照組相比較，N-去硫酸肝素組人胃癌細胞培養(yǎng)上清液VEGF含量下降，其中0.01mg/mlN-去硫酸肝素劑量組與陰性對照組相比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；0.1mg/mlN-去硫酸肝素組培養(yǎng)24h，VEGF的表達下降有意義(P＞0.05)；1mg/mlN-去硫酸肝素劑量組在12h、24h，VEGF均顯著下降(P＜0.01.)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，N-去硫酸肝素各濃度組胃癌細胞VEGFm

9、RNA表達均顯著下降(P＜0.01)。N-去硫酸肝素對胃癌細胞VEGFmRNA表達的抑制作用為1mg/ml＞0.1mg/ml＞0.01mg/ml(P＜0.01)，存在劑量依賴性。在同一濃度，予N-去硫酸肝素作用24h，胃癌細胞VEGFmRNA表達較12h顯著降低(P＜0.01.)，提示N-去硫酸肝素對胃癌細胞VEGFmRNA表達的抑制作用具有時間依賴性。結(jié)果表明，N-去硫酸肝素可以顯著抑制體外培養(yǎng)人胃癌細胞VFGF的表達，且具有時間、劑