右旋檸烯抗胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)將檢測多種人胃癌細(xì)胞和手術(shù)切除胃癌標(biāo)本中VEGF-C表達(dá)水平,分析其與腫瘤生物學(xué)行為和臨床病理特征的關(guān)系,并在此基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)裸小鼠原位移植模型和體外粘附、侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)右旋檸烯對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移能力的抑制作用,在細(xì)胞和分子水平探討其作用機(jī)理,并為該藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).第一部分 胃癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)水平與粘附、侵襲能力的關(guān)系 目的:觀察不同胃癌細(xì)胞株VEGF-C蛋白表達(dá)與胃癌細(xì)胞體外粘附、侵襲能力的關(guān)系,探討VEGF-C對(duì)胃癌細(xì)

2、胞轉(zhuǎn)移潛能的作用.方法:三種人胃腺癌細(xì)胞BGC-823、SGC-7901、MKN-45,常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5﹪CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取決于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞備用.Western-blot法檢測腫瘤細(xì)胞裂解液中VEGF-C蛋白表達(dá)水平;以纖維粘連蛋白和層粘連蛋白為作用對(duì)象,檢測不同胃癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附作用;利用Transwell小室,以Matrigel和纖維粘連蛋白構(gòu)建重組基底膜,檢測胃癌細(xì)胞侵襲人工基底

3、膜能力;針對(duì)VEGF-C基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)合成反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN),通過脂質(zhì)體介導(dǎo)對(duì)VEGF-C高表達(dá)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染;蛋白印跡檢測反義寡核苷酸封阻后VEGF-C和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metal proteinase 2,MMP-2)蛋白表達(dá);體外粘附實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的改變.第二部分 右旋檸烯對(duì)高轉(zhuǎn)移人胃癌細(xì)胞體外粘附、侵襲能力的抑制

4、目的:以高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為對(duì)象,觀察右旋檸烯對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附、侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)腫瘤生物學(xué)行為的影響,探討其抗腫瘤作用機(jī)制.方法:1、以MTT比色法檢測右旋檸烯對(duì)胃癌細(xì)胞生存的抑制作用,確定右旋檸烯無毒劑量(對(duì)細(xì)胞生存無明顯細(xì)胞毒作用的最大劑量);2、以纖維粘連蛋白和層粘連蛋白(細(xì)胞外基質(zhì)主要成分)為作用對(duì)象,檢測右旋檸烯對(duì)胃癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附作用的影響;3、利用Transwell小室,以Matrigel和Fibr

5、onectin構(gòu)建重組基底膜,檢測右旋檸烯對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲人工基底膜能力的影響;4、應(yīng)用Western-blot法檢測右旋檸烯對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC-7901條件培養(yǎng)液(conditional medium,CM)中VEGF-C、MMP-2和組織基質(zhì)蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix proteinase,TIMP-2)蛋白表達(dá)的影響.第三部分 人胃癌VEGF-C表達(dá)與腫瘤微血管、淋巴管密度及淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系 目的

6、:探討人胃癌組織VEGF-C表達(dá)與血管、淋巴管密度及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系.方法:采用免疫組化SP法檢測68例人胃癌組織中VEGF-C、CD-31及淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物VEGFR-3,計(jì)算VEGF-C表達(dá)陽性率及腫瘤微血管和微淋巴管密度.第四部分 右旋檸烯對(duì)人胃癌移植瘤淋巴轉(zhuǎn)移的抑制 目的:觀察右旋檸烯(d-limonene,D-L)對(duì)人胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用,探討其抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制.方法:人胃癌細(xì)胞株SGC-7901裸鼠皮下接種,成瘤后傳代獲得實(shí)