欖香烯抗喉癌作用的實驗研究.pdf

1、本文論述了欖香烯抗喉癌作用的實驗研究。 一、研究目的：通過體內(nèi)外實驗觀察欖香烯對喉癌的治療作用，通過免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測Ki67、VEGF-C和VEGFR-3的表達，探討欖香烯治療喉癌的機理。 二、實驗材料和方法： (一) 實驗材料：喉鱗癌Hep-2細胞株購自上海中國科學院細胞庫。 欖香烯乳100mg/20ml(批號：H10960114)購自大連金港制藥公司。 BALB/c-nu裸鼠40

2、只，購自上海中國科學院實驗動物中心，5-6周齡，雌雄各半，體重19.28-22.668g，平均為21.27±0.80g。無特定病原體(Specific pathogenFree,SPF)條件飼養(yǎng)，保持一定濕度、溫度(25-28℃)。 (二) 實驗方法： 1、細胞培養(yǎng)和藥物毒性實驗： 體外培養(yǎng)人喉癌Hep-2細胞，分別以濃度為0(對照)、10、20、30……和120μg/ml的欖香烯處理24小時，應(yīng)用MTT比色法測

3、定不同濃度欖香烯對Hep--2細胞增殖的影響，并繪制劑量-效應(yīng)曲線；通過透射電鏡觀察檢測細胞凋亡；采用PI單染法用流式細胞儀檢測喉癌細胞的凋亡率，測定細胞周期。 2、建立移植瘤模型，進行藥物干預： 每只裸鼠于右耳后下皮下注射1×10<'9>個/L喉癌Hep-2細胞懸液0.2ml，待腫瘤生長25天，至直徑>1cm時，將40只裸鼠抽簽法隨機化平均分為兩組，任意選取其中一組作為治療組，治療前稱重，測量瘤體大小，經(jīng)檢驗兩組動物的

4、體重和瘤體積在處理前差異無統(tǒng)計學意義。兩組動物每3天腹腔給藥1次，同時測量腫瘤大小，計算腫瘤體積。每次注射欖香烯120mg/kg，對照組給予同等量PBS液，共給藥8次。停藥后3天，處死裸鼠，剝離腫瘤，稱量瘤重和鼠重，測量腫瘤長、短徑，并計算腫瘤體積和抑瘤率。快速將每一例腫瘤組織分為兩份，一份-80℃冰箱保存。另一份10％甲醛固定。 3、免疫組化SP法檢測Ki67、VEGF-C和VEGFR-3的蛋白表達： 兔抗人VEGF-

5、C多克隆抗體(rabbit anti-VEGF-C)，編號：ZA-0266；兔抗人VEGFR-3多克隆抗體(rabbit anti-VEGFR-3)，編號：ZA-0267；兔抗人ki-67單克隆抗體(rabbit anti-nuclear antigen monoclonal antibody)，編號：ZA-0502。一抗，SP-900(Histosain<'TM>-plus kits和DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)

6、品。實驗步驟按試劑盒說明書進行。陽性對照由廠家提供，用PBS代替一抗作為陰性對照。Ki67以細胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性；VEGF-C蛋白陽性表達為棕黃色染色，主要存在于細胞漿；VEGFR-3將脈管內(nèi)皮細胞胞漿染成棕黃色，脈管計數(shù)按照Weidner報道的方法。 4、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測VEGF-C和VEGFR-3基因表達： 取50-100mg移植瘤組織加人1ml TriPure溶液徹底勻漿。按TriPure試劑盒說明書用一步法

7、提取總RNA，用DNA/RNA測定儀測定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。VEGF-C、VEGFR-3和GAPDH引物由InvitrogenBiotechnology Co．合成。特異引物序列分別為： VEGF-C(5 92bp)： sense：5'-AGTTTTGCCAATTCACACTTCCTG-3’，antisense：5’．GTCATTGGCAGAAAACCAGTCTT3’； VEGFR-3(29

8、8bp)： sense：5’-AGCCATTCATCAACAAGCCT-3’，antisense：5’-GGCAACAGCTGGATGTCATA-3’； GAPDH(188bp)sense：5’．AATCCATGGCACCGTCAAGGCT-3’，antisense：5’-TCAGGTCCACCACTGACACGTT-3’； 在PCR反應(yīng)體系中含有：3μlcDNA、2.5mMdNTP2μl、10×PCR緩沖液2.

9、5μ1、滅菌蒸餾水16.7μl、Ex Taq 0.2μl、上下游引物各0.5μl，下游引物0.1μl。反應(yīng)條件：94℃變性3min；94℃ lmin、55℃C lmin30sec、72℃2min，30個循環(huán)；72℃7min。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠顯色。用UVP-8000凝膠成像分析儀進行攝像分析。用DL2000 DNA Marker作為分子大小對照確定陽性瓊脂糖凝膠電泳條帶。使用Band Leader Ver．3.0

10、圖像分析軟件對電泳條帶進行灰度掃描，計算VEGF-C、VEGFR-3與GAPDH產(chǎn)物條帶的灰度值比值，即得到VEGF-C和VEGFR-3表達的相對值。 5、統(tǒng)計學分析用SPSS13.0軟件完成，計數(shù)資料采用X<'2>檢驗，計量資料采用t檢驗及單因素方差分析，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。 三、研究結(jié)果 1、MTT實驗結(jié)果： 欖香烯對Hep-2細胞增殖抑制程度與藥物濃度之間呈直線關(guān)系，經(jīng)直線回歸，欖香

11、烯作用24小時對Hep-2細胞的半數(shù)生長抑制濃度：IC<,50>為62.70μg/ml。 2、流式細胞分析結(jié)果： 在沒有藥物干預時Hep-2細胞以Q<,0>G<,1>期細胞為主，占67.7％，也存在少量凋亡細胞，占3.41％。隨著作用藥物濃度的增加或作用時間的延長凋亡細胞數(shù)增加，G<,2>M期細胞增加,G<,0>G<,1>期細胞減少(P<0.01)。 3、透射電鏡結(jié)果： 實驗組細胞核染色質(zhì)發(fā)生邊集，固縮，

12、在細胞核膜周邊聚集形成新月體形或花瓣形，電子密度增強，具有凋亡細胞的特點。 4、移植瘤生長狀況： 40只人喉癌裸鼠移植瘤模型建立成功，5天后可見皮下腫瘤形成，并隨病期延長不斷長大。欖香烯治療的實驗組裸鼠狀態(tài)良好，體重無明顯減輕，移植瘤生長緩慢、停滯；對照組裸鼠狀態(tài)差，漸消瘦，呈惡病質(zhì)狀態(tài)，移植瘤呈結(jié)節(jié)狀，生長快，體積明顯比對照組大。從治療第7天開始兩組間腫瘤體積差異具有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.01。在欖香烯治療期間兩組

13、動物均無死亡。 欖香烯能明顯抑制喉癌的生長，抑瘤率為52.24％，在實驗組和對照組之間，鼠凈重、瘤重和瘤體積，經(jīng)t檢驗P值均<0.01，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。 5、病理學觀察： HE染色，光鏡下可見對照組腫瘤細胞核大濃染，細胞分裂象多見，壞死區(qū)少見；實驗組腫瘤細胞小，組織中細胞壞死程度、壞死灶周圍纖維化程度明顯比對照組高。 6、免疫組化結(jié)果： 實驗組移植瘤KI指數(shù)為28.88±3.15，對照組

14、為78.18±4.51；實驗組移植瘤VEGF-C蛋白表達積分為15.82±2.05，對照組為113.61±16.29；實驗組VEGFR-3陽性脈管密度的平均值為7.02±0.59，對照組為19.84±1.89；實驗組和對照組KI指數(shù)、VEGF-C蛋白表達積分和VEGFR-3陽性脈管密度之間差異具有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.01。 7、RT-PCR結(jié)果： 實驗組VEGF-C和V：EGFR-3mRNA表達相對值分別為1.00

15、18±0.0842和0.9697±0.251；對照組VEGF-C和VEGFR-3mRNA表達相對值分別為1.6313±0.0294和1.3631±0.1346；實驗組和對照組VEGF-C和VEGFR-3mRNA表達相對值之間的差異具有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.01。 四、研究結(jié)論 在體外：欖香烯對人喉癌Hep-2細胞增殖具有明顯抑制作用；欖香烯抑制人喉癌Hep-2細胞增殖與欖香烯誘導Hep-2細胞凋亡和干擾Hep-2細胞