欖香烯抗再狹窄的機(jī)理研究及其緩釋涂層的檢測(cè).pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療是現(xiàn)在治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的主要方法之一，但其術(shù)后3-6個(gè)月內(nèi)高達(dá)30％～50%的再狹窄發(fā)生率，使再狹窄的機(jī)理和防治研究成為該領(lǐng)域的焦點(diǎn)。近年，廣泛使用的雷帕霉素和紫杉醇藥物洗脫支架已經(jīng)使再狹窄率降低至10%以下，可是仍存在內(nèi)皮化延遲、晚期血栓等副作用，所以研發(fā)新型、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)、高效的支架涂層藥物尤為重要。
　　再狹窄是多種因素綜合作用的結(jié)果，包括血管內(nèi)膜損傷，血管平滑肌細(xì)胞遷移及增殖，血栓形

2、成，血管重塑等一系列病理過程，其中，血管平滑肌細(xì)胞過度增殖、遷移分泌大量的胞外基質(zhì)等異常的生物學(xué)表現(xiàn)是導(dǎo)致再狹窄發(fā)生的主要原因。欖香烯是中國自主研發(fā)的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，提取自中草藥姜科植物溫郁金，具有高效廣譜抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。前期研究顯示欖香烯可以抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，同時(shí)又能抑制血小板的聚集，擴(kuò)張血管，改善血循環(huán)，具有應(yīng)用于心血管系統(tǒng)，防治再狹窄的前景。脂質(zhì)體具有長期緩釋、主動(dòng)靶向、高效持續(xù)治療等優(yōu)點(diǎn)，所以制備欖香烯脂質(zhì)

3、體有可能成為新型、高效的抗再狹窄支架涂層藥物。本文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　?、贆煜阆?duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。分離和培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈原代血管平滑肌細(xì)胞；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究欖香烯對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響；劃痕法和小室法研究欖香烯對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)欖香烯濃度超過12.5μg/ml時(shí)，顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移（P<0.05），且作用具有劑量-時(shí)間依賴性。隨著欖香烯濃度的增加，處理原代血管平滑肌細(xì)胞后，細(xì)

4、胞鋪展面積減小、胞間連接被打斷、核質(zhì)皺縮，形態(tài)狹長。
　?、跈煜阆?duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)理研究。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)欖香烯對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響；免疫熒光檢測(cè)欖香烯對(duì)細(xì)胞骨架F-actin和胞內(nèi)Ca2+的影響；采用FX-4000T細(xì)胞張應(yīng)變加載系統(tǒng)，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞施加5%牽張幅度的周期性張應(yīng)變，加載頻率為1.0Hz，時(shí)間為12h，IncRNA芯片分析欖香烯對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，WB檢測(cè)加載前后PCNA、P53、Cx4

5、3蛋白的量。結(jié)果顯示，欖香烯能夠阻滯細(xì)胞于S/G2期，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且作用具有劑量-時(shí)間依賴性。25μg/ml的欖香烯作用血管平滑肌細(xì)胞與對(duì)照組比較，細(xì)胞排列紊亂、稀疏，形態(tài)狹長，且細(xì)胞骨架的肌絲變粗、熒光增強(qiáng)。25μg/ml的欖香烯作用血管平滑肌細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度先明顯升高1倍再恢復(fù)到正常水平。力學(xué)加載后，與對(duì)照組比較，欖香烯處理組血管平滑肌細(xì)胞的基因表達(dá)譜中相對(duì)無藥物處理組有1417個(gè)基因表達(dá)差異在2倍以上，涉

6、及PPAR、MAPK、Akt、Erk1/2等約34個(gè)信號(hào)通路，其中P53的表達(dá)增加，PCNA和Cx43的表達(dá)下降。
　?、蹤煜阆┲|(zhì)體緩釋涂層的制備及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。用乙醇注入法制備欖香烯脂質(zhì)體；靜電電噴制備欖香烯脂質(zhì)體涂層；液相色譜檢測(cè)欖香烯脂質(zhì)體涂層的緩釋效果；藥物緩釋涂層與血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，分析對(duì)其增殖和周期的影響。實(shí)驗(yàn)制備的欖香烯脂質(zhì)體大小均勻，呈卵圓形。結(jié)果表明，在1h、36h、7d、28d時(shí)，欖香烯脂

7、質(zhì)體電噴涂層和欖香烯注射液涂層比較，具有顯著的緩釋效果（P<0.05）。10μg/mm2、15μg/mm2的欖香烯藥物電噴膜與對(duì)照組相比較，對(duì)VSMC的增殖有明顯的抑制作用（P<0.05），且阻滯細(xì)胞分裂周期于S期和G2期。
　　綜上，欖香烯可以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，阻滯周期，促進(jìn)凋亡，其作用涉及多種蛋白因子及信號(hào)通路。欖香烯脂質(zhì)體具有緩釋效果和抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用。本研究為欖香烯作為支架涂層藥物在經(jīng)皮冠脈介入治療領(lǐng)域的