HGF-c-met調(diào)控肝素酶表達促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率在全世界特別是東亞國家如中國、韓國等地居高不下。最新文獻報道每年有640000男性和350000女性被診斷為胃癌。同時每年有464000男性和273000女性死于胃癌。90％腫瘤患者的死亡都是由于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移引起的。因此，有必要對胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移進行研究，以減緩患者的死亡。肝素酶(HPA)作為細胞內(nèi)唯一一種內(nèi)源性核苷內(nèi)切酶被認為在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。肝素酶通過降解硫酸乙酰肝

2、素蛋白多糖，可以使綁定在細胞外基質(zhì)中的相關(guān)細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等的釋放，從而使其能夠結(jié)合于上皮細胞表面，從而促進細胞的增殖及遷移。然而，目前有關(guān)調(diào)控肝素酶表達的分子機制研究較少。目前已經(jīng)證實在腫瘤組織中突變的或者失活的p53基因能夠促進肝素酶的表達。同時，也有文獻證實SP1及 Ets家族在促進肝素酶表達的過程中發(fā)揮重要作用。我們前期也

3、證實，靶向肝素酶的T細胞多肽疫苗能夠顯著抑制腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移，此結(jié)果提示肝素酶在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，有必要探索肝素酶在胃癌中表達的具體機制。
　　c-met作為一種癌基因廣泛表達于腫瘤細胞的表面并且在多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、骨肉瘤及腦腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我們前期通過30例臨床標本發(fā)現(xiàn)c-met及HPA在胃癌組織中的表達較癌旁組織明顯增加，同時c-met和HPA在胃癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)(P<0.

4、01)。同時，既往文獻報道，肝細胞生長因子(HGF)通過與c-met結(jié)合，能夠激活一系列信號通路如PI3K/Akt、ERK、NF-κB及STAT3進而促進靶基因的表達，從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。那么HGF/c-met信號通路是否可以促進HPA的表達，從而促進胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，此研究尚未有文獻報道。因此，本課題在國家自然科學基金的資助下。系統(tǒng)的研究了胃癌組織及細胞中HGF、c-met及HPA的表達情況，并從分子水平闡明了HGF/c-met可以

5、通過激活PI3K/Akt信號通路，進而活化NF-κB信號通路從而促進p65入核，使其結(jié)合于HPA啟動子的-769~-760 bps區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平促進肝素酶的表達，進而促進胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.通過免疫組化檢測HGF及HPA在58例胃癌組織及癌旁組織中的表達情況。統(tǒng)計分析HGF及HPA的表達與胃癌患者的臨床病理分期（性別，年齡，腫瘤大小，分化，TNM分期，侵潤深度及淋巴及轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。進一步分析肝HGF與H

6、PA之間的相關(guān)性，研究HGF和HPA的表達與胃癌患者生存的關(guān)系。
　　2.通過qRT-PCR及Western blot實驗分析外源性肝細胞生長因子分別刺激MKN74和MKN45細胞后，肝素酶mRNA和蛋白的表達變化情況。
　　3.肝細胞生長因子刺激MKN74和MKN45細胞的同時加入c-met特異性抑制劑Su11274，共同培養(yǎng)24小時。Western blot檢測肝素酶蛋白表達的變化。
　　4.肝細胞生長因子分別刺激

7、MKN74和MKN45細胞0，15，30，45，60，90分鐘后收集蛋白，Western blot檢測磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表達變化。進一步加入PI3K/Akt的抑制劑GSK及NF-κB信號通路的抑制劑Bay，檢測磷酸化AKT及磷酸化p65蛋白表達變化。
　　5. HGF刺激MKN74細胞的同時分別加入Su11274，GSK和Bay后培養(yǎng)24小時，Western blot檢測肝素酶表達的變化情況。
　　6.雙熒光素酶

8、實驗驗證肝細胞生長因子是否可以提高肝素酶啟動子的活性。
　　7.生物信息學預測p65與肝素酶啟動子結(jié)合的潛在結(jié)合位點。
　　8.根據(jù)生物信息學預測結(jié)果，進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀驗證p65與肝素酶啟動子的具體結(jié)合位點。
　　9.CCK-8實驗，劃痕實驗,Transwell實驗及裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移實驗分析肝細胞生長因子及肝素酶在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　10.酶聯(lián)免疫法檢測過表達肝素酶后MKN74細胞和干擾肝素酶后MK

9、N45細胞的肝細胞生長因子的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.證實HGF及HPA在58例胃癌組織中明顯高表達，并且與胃癌患者的不良預后密切相關(guān)。通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)在58例臨床標本中HGF在胃癌組織的表達較癌旁組織中明顯增高（P<0.001）；HPA在胃癌組織中的表達亦較癌旁組織明顯升高（P<0.001）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HGF高表達與胃癌患者的TNM分期，淋巴及轉(zhuǎn)移及侵潤深度密切相關(guān)。同時HPA高表達與胃癌患者的TNM分期及

10、侵潤深度密切相關(guān)。進一步發(fā)現(xiàn) HGF高表達與胃癌患者的不良預后密切相關(guān)。同樣胃癌組織高表達 HPA與患者的不良預后密切相關(guān)。最后，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)HGF及HPA在胃癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)（R=0.7011，P<0.001）。
　　2. HGF刺激能夠明顯增加MKN74細胞HPA的表達，但對MKN45胃癌細胞HPA的表達則沒有影響。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)當加入肝細胞生長因子刺激1小時后，MKN74細胞的肝素酶表達明顯增加

11、。然而肝細胞生長因子刺激對MKN45細胞肝素酶mRNA表達沒有影響。Western blot同樣發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子刺激能夠顯著增加MKN74細胞肝素酶蛋白的表達，但對MKN45細胞沒有影響。肝細胞生長因子刺激同時加入c-met抑制劑Su11274后MKN74和MKN45細胞的肝素酶的表達明顯下降。
　　3.證實HGF/c-met通過激活PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路促進HPA的表達。Western blot發(fā)現(xiàn)

12、HGF刺激MKN74細胞30分鐘后磷酸化AKT的表達明顯增加，而刺激45分鐘后磷酸化p65的表達明顯增加。進一步在HGF刺激MKN74細胞的同時，加入GSK及Bay后發(fā)現(xiàn)，Bay對磷酸化AKT的表達沒有影響而GSK能夠明顯抑制磷酸化p65的表達。由此說明，肝細胞生長因子首先激活PI3K/Akt信號通路進而激活下游的NF-κB信號通路。進一步HGF刺激MKN74細胞的同時加入Su11274，GSK和Bay后共同培養(yǎng)24小時，發(fā)現(xiàn)加入抑制劑

13、后肝素酶的表達明顯減少。以上結(jié)果充分說明，肝細胞生長因子通過激活PI3K/Akt信號通路進而激活下游的NF-κB信號通路促進肝素酶的表達。
　　4.證實p65通過結(jié)合于肝素酶啟動子促進HPA的表達。雙熒光素酶實驗證實，肝細胞生長因子能夠明顯增加肝素酶啟動子活性。進一步通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，p65在肝素酶的啟動子區(qū)有3個潛在的結(jié)合位點。構(gòu)建相關(guān)引物后通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，p65能夠特異性的結(jié)合于肝素酶啟動子-769～-76

14、0 bps區(qū)，但并不能結(jié)合于其他兩個結(jié)合位點。進一步我們構(gòu)建了缺失突變-769～-760 bps區(qū)的肝素酶啟動子，再次進行雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子并不能提高突變后的肝素酶啟動子活性。以上結(jié)果充分證實p65通過結(jié)合于肝素酶啟動子-769～-760bps區(qū)促進其表達。
　　5.體內(nèi)外實驗證實HGF/c-met-HPA信號通路在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。劃痕實驗及Transwell實驗證實HGF能夠顯著促進MKN74細胞的侵

15、襲轉(zhuǎn)移能力，而其對MKN45細胞的侵襲轉(zhuǎn)移則沒有影響。但是HGF刺激的同時加入Bay后，MKN74和MKN45細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力均明顯下降。由此說明，HGF及NF-κB信號通路在胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。進一步當在MKN74細胞過表達肝素酶后，Transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達肝素酶后MKN74細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強。而在MKN45細胞中干擾肝素酶后其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。以上結(jié)果證實肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在體

16、內(nèi)實驗中，干擾肝素酶表達的MKN45細胞在小鼠腹腔形成的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量較對照組的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量及大小明顯減少，再次通過體內(nèi)實驗驗證肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　　6.證實HPA可以反向調(diào)控HGF的表達。在MKN74細胞中過表達肝素酶后，上清中的肝細胞生長因子表達較對照組明顯升高。相反，在MKN45細胞中干擾肝素酶后，上清中的肝細胞生長因子表達較對照組明顯降低。以上結(jié)果充分說明，肝素酶可以反向調(diào)控肝細胞生長因子的表達。
　

17、　結(jié)論：
　　1.HGF和HPA在胃癌組織的表達明顯高于癌旁組織(p<0.001)，并且與患者的不良預后預后密切相關(guān)；HGF和HPA在胃癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)(R=0.7011，p<0.001)。外源性HGF通過與c-met結(jié)合促進MKN74細胞肝素酶的表達，但對MKN45細胞沒有影響。
　　2.HGF結(jié)合于c-met激活PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路促進肝素酶的表達。p65入核后結(jié)合于肝素酶啟動子-

18、769～-760bps區(qū)促進肝素酶的表達。
　　3.HGF及肝素酶在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　　4.肝素酶可以反向調(diào)控HGF的表達，從而形成正向反潰調(diào)控通路，在胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　總之，通過本課題我們證實 HGF通過結(jié)合于其特異性受體c-met激活 PI3K/Akt信號通路及下游的NF-κB信號通路，進而使p65入核后結(jié)合于肝素酶的啟動子促進其表達。另外肝素酶可以反向調(diào)控肝細胞生長因子的