RhoC調(diào)控骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的研究.pdf

1、目的:探討RhoC骨肉瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和調(diào)控的分子機制。
　　方法:通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細(xì)胞株SOSP-9607H9(低侵襲能力組)及SOSP-9607E10(高侵襲能力組),生長曲線比較兩個細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力,應(yīng)用RT-PCR和Western-blot方法在mRNA和蛋白水平檢測RhoC的表達(dá)水平,進(jìn)一步采用劃痕愈合實驗(Wounding heal assay)和侵襲小室實驗(Transwell as

2、say)比較兩種不同骨肉瘤細(xì)胞株的侵襲運動能力,分析骨肉瘤細(xì)胞侵襲運動能力與RhoC的表達(dá)水平的相關(guān)性;通過構(gòu)建pCDNA3.1-RhoC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用Life2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染低侵襲潛能組SOSP-9607H9細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,獲得過量表達(dá)RhoC蛋白的骨肉瘤細(xì)胞模型實驗,從逆向驗證RhoC的高表達(dá)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的侵襲運動;設(shè)計RhoCsiRNA片段,將T4載體和SiRNA-RhoC用限制性內(nèi)切酶酶切連接,采用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染MSC

3、Vneo-SiRhoC片段至逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67細(xì)胞,取病毒上清干擾沉默過量表達(dá)RhoC的高侵襲轉(zhuǎn)移潛能SOSP-9607E10細(xì)胞株,再次采用劃痕實驗和侵襲小室檢測兩種骨肉瘤細(xì)胞株的侵襲運動能力。
　　結(jié)果:兩組細(xì)胞在開始接種時期無差異,當(dāng)進(jìn)而細(xì)胞對數(shù)生長期后,SOSP-9607 E10細(xì)胞增殖能力明顯增強。在RhoCmRNA水平,高侵襲轉(zhuǎn)移潛能SOSP-9607E10細(xì)胞中目的基因RhoCmRNA(181bp)條帶和內(nèi)參

4、GAPDH基因條帶(500bp)的表達(dá)光密度比值(1.93±0.11)高于低侵襲潛能組SOSP-9607H9細(xì)胞(0.71±0.09),差異有顯著性(p<0.05);在RhoC蛋白水平,高侵襲轉(zhuǎn)移潛能SOSP-9607E10細(xì)胞中目的蛋白RhoC條帶(27Kda)表達(dá)和內(nèi)參Actin條帶(42Kda)的表達(dá)光密度比值(2.57±0.07)高于低侵襲潛能組SOSP-9607H9細(xì)胞(0.95±0.03),差異有顯著性(p<0.05)。過量

5、表達(dá)RhoC基因SOSP-9607E10細(xì)胞與低表達(dá)RhoC基因SOSP-9607H9細(xì)胞的劃痕愈合能力完全不同;劃痕24小時過量表達(dá)RhoC基因細(xì)胞基本上爬滿劃痕區(qū)域,達(dá)到劃痕的愈合,而低表達(dá)RhoC基因細(xì)胞則只有少量細(xì)胞爬行劃痕區(qū)域,仍然留有明顯的劃痕存在。兩個細(xì)胞株侵襲透過人工基底膜的平均細(xì)胞數(shù)分別為42.5±2.8和5.1±1.2個,比較兩組細(xì)胞穿透人工基底膜平均細(xì)胞數(shù)的差異具有高度顯著性(P=0.000)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1

6、-RhoC質(zhì)粒組SOSP-9607H9細(xì)胞中目的基因RhoCmRNA(181bp)條帶和內(nèi)參GAPDH基因條帶(500bp)的表達(dá)光密度比值(1.75±0.07)高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒細(xì)胞中RhoCmRNA的表達(dá)(0.69±0.12),差異有顯著性(p<0.05);在RhoC蛋白水平,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RhoC質(zhì)粒后SOSP-9607E10細(xì)胞中目的蛋白RhoC條帶(27Kda)表達(dá)和內(nèi)參Actin條帶(42Kda)的表達(dá)光密

7、度比值(2.13±0.12)高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒SOSP-9607H9細(xì)胞(0.91±0.14),差異有顯著性(p<0.05),說明RhoC基因已被轉(zhuǎn)染到SOSP-9607H9細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄合成蛋白,進(jìn)一步采用劃痕愈合實驗和侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn),獲得過量表達(dá)RhoC的細(xì)胞侵襲運動能力增強。構(gòu)建轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCVneo-SiRhoC片段,采用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67,轉(zhuǎn)染效率約為65％左右,經(jīng)用400ug/m

8、l G418篩選,MSCVhyg-GFP用100 ug/ml Hygromycin篩選,獲得上清病毒滴度為2×10~6cfu/ml,用此濃度病毒上清轉(zhuǎn)染SOSP-9607E10細(xì)胞效率較高約96%,Western-bolt方法檢測SiRhoC前后RhoC蛋白的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染SiRhoC片段后SOSP-9607E10細(xì)胞中過量表達(dá)的RhoC被沉默。過量表達(dá)RhoC基因沉默后的SOSP-9607E10細(xì)胞則只有少量細(xì)胞爬行劃痕區(qū)域,仍然留有明

9、顯的劃痕存在,在高倍鏡下計數(shù)SOSP-9607E10骨肉瘤細(xì)胞株侵襲過人工基底膜的平均細(xì)胞數(shù)干擾前和干擾后分別為47.9±5.6和8.4±2.2個,比較兩組細(xì)胞穿透人工基底膜平均細(xì)胞數(shù)的差異具有高度顯著性(P=0.000)。
　　結(jié)論:RhoC的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞株SOSP-9607H9和SOSP-9607E10具有不同腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和不同侵襲運動能力差異的原因之一;RhoC的過量表達(dá)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞運動能力的機制在骨