甲狀旁腺激素1-34與低滲透壓聯(lián)合調控成骨樣細胞MG63生物學效應的研究.pdf

1、隨著人口老齡化問題日益嚴重，口腔修復患者中原發(fā)性骨質疏松癥的老年患者越來越多。由于骨質疏松導致骨量不足、骨密度過低，不能進行正常的種植修復，或者常規(guī)修復效果不理想。如何治療和控制骨質疏松的發(fā)病，解決因此帶來的骨量不足，重建骨組織的健康結構和功能，是口腔醫(yī)學，骨整形、以及骨缺損重建等臨床醫(yī)學所關心的問題。 甲狀旁腺激素(PTH)是一種重要的體內維持鈣穩(wěn)態(tài)及骨代謝的全身性調節(jié)激素，其靶細胞為成骨細胞和腎小管細胞。2002年12月，F(xiàn)

2、orteo商品名叫特立派汰的人工合成PTH被FDA認證，作為治療骨質疏松藥物。研究證明，PTH對依據給藥方式不同對骨組織產生雙重作用。小劑量、間斷式甲狀旁腺激素(PTH)皮下注射能有效地促進骨骼合成；持續(xù)作用刺激骨轉化，增加破骨細胞的活性和降低皮質骨量，導致松質骨喪失。PTH主要通過骨形成的三個階段發(fā)揮作用的：1，刺激前期成骨細胞增殖；2，促進前期成骨細胞，但是抑制成熟的成骨細胞的分化；3，抑制成骨細胞凋亡。其中是否前期成骨細胞增殖提高

3、還不是很清楚。PTH對骨組織的另一重作用是持續(xù)性大劑量注射PTH，則抑制成骨細胞增殖分化，活化破骨細胞。 通過PTH以及應力對成骨細胞作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，二者對成骨細胞的影響有很多共同的作用機理，這預示PTH和機械應力之間可能有著某種協(xié)同關系。有關PTH對成骨樣細胞的機械應力響應的調節(jié)作用的基礎研究，目前還未見國內報道。因此，有必要對PTH調控成骨樣細胞的機械響應機制作進一步的研究，并尋求發(fā)現(xiàn)PTH和機械應力間的內在聯(lián)系。目的：

4、 本課題旨在通過對體外培養(yǎng)的人成骨樣細胞MG63，加載不同強度的牽張刺激，通過測定不同刺激強度對該細胞的線粒體跨膜電位(△Ψm)、ALPase、細胞增殖及細胞內鈣離子濃度的變化，初步篩選出一個牽張閾值；進而采用低濃度的甲狀旁腺激素(20ng/ml)，采用間斷和持續(xù)作用于閾上刺激后的人成骨樣細胞MG63，通過觀察其礦化結節(jié)的形成情況，以及采用RT-PCR技術檢測人甲狀旁腺激素相關蛋白(PHT/PTHrP)和骨鈣素(OCN)的mRN

5、A表達情況，初步探討甲狀旁腺激素對不同機械力作用下的成骨樣細胞的生物學效應。以期探討通過全身或局部藥物作用，來影響機械載荷下的牙槽骨改建，預防或減緩其吸收。為口腔修復、種植和正畸臨床醫(yī)學提供基礎性的研究。 方法： 1．采用低滲透液式加力方式，對體外培養(yǎng)的細胞進行牽張刺激。采用不同濃度的甘露醇調節(jié)低滲透壓的大小，模擬體外細胞受力的強度。 2．采用人成骨樣細胞MG63的細胞株進行體外培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，繪制細胞生長曲

6、線為低滲透壓加載實驗準備實驗細胞。 3．采用低滲透壓對體外培養(yǎng)的MG63進行加載，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀測細胞線粒體形態(tài)，圖像分析軟件分析線粒體跨膜電位的變化；通過分析ALP以及細胞內鈣離子濃度的變化分析低滲透壓對MG63的影響，初步篩選出一個低滲透壓閾值，為后期PTH實驗研究準備實驗條件。 4．采用化學熒光檢測技術，對加入細胞培養(yǎng)基中不同時間的PTH的免疫活性進行藥物動力學檢測，分析PTH的代謝特性，并繪制代謝曲線

7、。排除由于PTH代謝導致藥效濃度過低，可能產生的實驗結果的偏差。 5.對閾上刺激后的MG63進行低濃度的PTH間斷和連續(xù)刺激，采用RT-PCR技術檢測細胞內甲狀旁腺激素相關蛋白PHT/PTHrP和骨鈣素OCN的mRNA表達情況。 6.采用茜素紅染色技術，觀察PTH作用前后的MG63礦化誘導情況，并采用分光光度儀定量檢測鈣化結節(jié)的情況。 結果： 1.通過對線粒體膜電位的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓的降低，以及作用的

8、時間延長，膜電位有增高的趨勢，其中277mOsm膜電位輕度增高，但與對照組沒有明顯差別(P>0.05)；240mOsm組的膜電位總體高于對照組(P<0.05)，且作用2h、4h和6h時，膜電位明顯高于對照組，在作用4h時達到峰值。163mosm在作用初期，就有明顯的膜電位增高，但是隨著作用時間的延長，膜電位降低，且作用4h以后，已經明顯低于對照組(P<0.05)。 2.通過MTq、生長曲線分析發(fā)現(xiàn)所有細胞均近似“s”形，有明顯的

9、滯留期、指數(shù)生長期、平臺期。隨著滲透壓的降低，細胞滯留期變短，對數(shù)生長期提前，較早進入平臺期。 3.通過對低滲壓作用后的MG63的ALP，以及胞內鈣離子濃度(Ca<'2+>);變化分析發(fā)現(xiàn)，低滲處理組中，277mOsm、240mOsm和163mOsm組早期ALP活性降低，以后隨著作用時間延長，有所增加，但是仍然低于對照組。三個低滲處理組中各時間組的(Ca<'2+>)i均高于對照組(P<0.05)，且隨著作用時間延長也是呈現(xiàn)增高趨

10、勢，分別在24h、12h和8h達到峰值，以后逐漸回落，但是仍然明顯高于對照組。 4.通過對PTH藥物動力學研究發(fā)現(xiàn)，在實驗設計的觀測期內(24h)，PTH的免疫活性沒有明顯降低。說明實驗設計的觀測期合理，排除了實驗結果是由于激素代謝導致藥效降低引起的誤差。 5.PTH對成骨樣細胞MG63的礦化影響具有時間依賴性，與藥物濃度關系不大。 6.間斷使用PTH和牽張力具有刺激成骨樣細胞MG63增殖分化的作用；小劑量、間斷

11、PTH刺激應力狀態(tài)下的成骨樣細胞6h，PTHrPmRNA高表達，OCmRNA表達受到抑制。刺激3h則PTHrPmRNA的表達降低，而OCmRNA表達輕度升高；作用1h則PTHrPmRNA和OCmRNA的表達與對照組沒有明顯差異；相反PTH連續(xù)作用24h時，PTHrPmRNA和OCmRNA的表達均明顯降低。 7.間斷低濃度使用hPTH1-34，有助于應力載荷后的成骨增殖活力的恢復，緩解過載荷狀態(tài)下成骨細胞的增殖抑制，利于基質骨礦化

12、的形成；且加強地塞米松的成骨誘導作用。 結論： 1.低滲透液作為一種應用于研究細胞離子通道的加力方式，同樣可以適用于研究細胞體外受力的生物學特性。其隨著滲透壓的逐漸降低，對成骨樣細胞所產生的作用效果，與以往采用四點彎曲等加載方式有著一定的相似作用趨勢。 2.采用低滲透液進行細胞體外受力研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下(270-240mOsm，作用4—6小時)，對成骨樣細胞MG63具有促進增殖分化的作用，過強(163mOsm

13、，作用4—6小時)、過小(270mOsm，作用0.5—2小時)的應力都不利于該細胞成熟分化。 3.對閾上刺激后的MG63，采用小劑量(20ng/ml)hPTH1-34的間斷誘導，具有調節(jié)PTHrPmRNA和OCmRNA的表達的作用。其中對閾上刺激后4h，PTH間斷作用6h，細胞的PTHrPmRNA的表達明顯增高，OCmRNA的表達則受到一定的抑制作用。結合胞內游離鈣濃度的變化，說明兩種基因表達的變化可能與胞內鈣離子通道有關。同時