轉(zhuǎn)染有骨形成蛋白-2、7真核表達載體的MG63細胞與殼聚糖膜組合的生物學性能研究.pdf

1、背景:
　　 骨缺損是一類常見、多發(fā)且治療復(fù)雜的疾患,因創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等后天因素及先天畸形等原因造成,累及外顯和功能部位,不僅給患者造成嚴重的形態(tài)畸形和功能障礙,也成為困擾臨床醫(yī)師的一大難題。近年來,隨著材料科學和生物學的發(fā)展,組織工程學作為高新技術(shù)成為一門與多學科交叉的新興邊緣學科隨之應(yīng)運而生,并得到了迅速的發(fā)展,利用組織工程學方法構(gòu)建組織工程骨已成為骨移植材料的研究熱點。
　　 目的:
　　 殼聚糖(chi

2、tosan,CS)材料與種子細胞具有較好的生物相容性是決定殼聚糖在骨組織工程中應(yīng)用的關(guān)鍵因素。本實驗將轉(zhuǎn)染有成骨生物活性因子基因的細胞與殼聚糖膜材料共同培養(yǎng),通過細胞增殖、粘附實驗,觀察轉(zhuǎn)染細胞與殼聚糖膜支架材料的生物相容性。
　　 方法:
　　 1骨形成蛋白-2,7真核表達載體的構(gòu)建:
　　 1.1真核表達載體的構(gòu)建:分別構(gòu)建BMP-2/pcDNA3.1(-)、BMP-7/pcDNA3.1(-)表達載體,并經(jīng)測

3、序、雙酶切、PCR鑒定。
　　 1.2將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MG63細胞,通過RT-PCR檢測hBMP-2、hBMP-7mRNA水平表達,通過Western blot、免疫細胞化學染色檢測hBMP-2、hBMP-7蛋白在細胞內(nèi)的表達。
　　 2轉(zhuǎn)染細胞在殼聚糖膜表面的增殖與分化情況的研究:
　　 2.1 MTS增殖檢測:將材料及細胞置于96孔板中培養(yǎng),分正常MG63組,MG63/CS組;轉(zhuǎn)染BMP-2組,轉(zhuǎn)

4、染BMP-2/CS組;轉(zhuǎn)染BMP-7組,轉(zhuǎn)染BMP-7/CS組,在24h、48h、72h、96h時,MTS法檢測細胞增殖情況。
　　 2.2掃描電鏡檢測:將材料及細胞于24孔板中,分為MP-2/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組與BMP-7/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組,培養(yǎng)24h、72h、120h,收集準備樣本,掃描電鏡觀察細胞粘附情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.真核表達載體的構(gòu)建:經(jīng)測序

5、、雙酶切、PCR鑒定,結(jié)果表明成功構(gòu)建了BMP-2/pcDNA3.1(-)、BMP-7/pcDNA3.1(-)表達載體。
　　 2.轉(zhuǎn)染及表達:RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細胞中有目的基因的表達,Westernblot及細胞免疫組化法均檢測到轉(zhuǎn)染細胞中有目的蛋白BMP-2、BMP-7的表達,表明轉(zhuǎn)染后重組載體在MG63細胞中成功表達。
　　 3.MTS增殖實驗:轉(zhuǎn)染細胞在材料上培養(yǎng)24h、48h、72h時MTS檢測值的增長表

6、明隨著時間的推移,細胞在材料表面能生長增殖。但與正常MG63細胞組相比,轉(zhuǎn)染組的增殖無明顯差異(P＞0.05),表明體外殼聚糖材料對載有轉(zhuǎn)染有目的基因的MG63細胞的增殖無明顯促進作用。
　　 4.掃描電鏡觀察:分為BMP-2/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組與BMP-7/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染MG63+CS組,于培養(yǎng)24h、72h、120h時的電鏡照片顯示分別轉(zhuǎn)染有BMP-2、BMP-7基因的MG63細胞在殼聚糖