新型頸前路鎂合金鋼板對MG63細(xì)胞的增殖與成骨能力的影響.pdf

1、背景與目的：
　　頸椎前路椎間融合內(nèi)固定術(shù)（anterior cervical discectomy and fusion，ACDF）長久以來一直是治療頸椎疾病的傳統(tǒng)術(shù)式。雖然前路固定鋼板增強(qiáng)了頸椎穩(wěn)定性，但諸如咽喉部異物感、吞咽障礙、鋼板松動脫落甚至刺傷食管等內(nèi)固定物并發(fā)癥時有報道[1,2]。為了解除傳統(tǒng)鈦合金固定鋼板的潛在危險，國內(nèi)外越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向生物可吸收材料的研究上。近年來鎂合金因其在彈性模量、體內(nèi)代謝方面的優(yōu)勢

2、成為了新型內(nèi)固定材料的研究熱點(diǎn)。生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)鎂合金頸前路鋼板與傳統(tǒng)鈦合金鋼板具有相似的力學(xué)特性[3,4]。本研究參照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-5與ISO10993-12利用MG-63細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，并觀察MG-63細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，Col-1）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等成骨因子的表達(dá)變化以及堿性磷酸酶（alkaline phos

3、phatase，ALP）的活性以探討鎂合金前路鋼板的生物相容性以及其對成骨過程的影響。
　　材料與方法：
　　按照ISO10993-12將Mg–2wt％Zn合金（由鄭州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供）制備成不同濃度的浸提液（未稀釋時質(zhì)量體積比為0.2g/ml）。MG-63細(xì)胞復(fù)蘇后加入培養(yǎng)液，靜置于37℃、5%CO2飽和95%濕度條件下培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為2組，空白對照組：使用未處理的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組：使用不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培

4、養(yǎng)基。觀察細(xì)胞形態(tài)定期更換培養(yǎng)液。
　　使用不同稀釋倍數(shù)的浸提液處理細(xì)胞，于第1,2,3天采用CCK-8法檢測各組內(nèi)光吸收值（OD）以評估細(xì)胞增殖活性。在10倍稀釋濃度浸提液處理后的第1、3、5、7、9天，以及不同稀釋倍數(shù)的浸提液處理后第5天，采用可見光比色法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。于干預(yù)后第5天裂解細(xì)胞利用BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)蛋白總量。同時提取蛋白質(zhì)與RNA并采用免疫蛋

5、白印跡技術(shù)（western-blot）與實(shí)時定量PCR技術(shù)（real-time quantitative PCR）檢測目標(biāo)蛋白Col-1、OC、OPN與相關(guān)RNA的表達(dá)量，評估鎂合金對MG-63細(xì)胞成骨能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1各實(shí)驗(yàn)組CCK-8檢測結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)組在1x與2.5x稀釋濃度條件下細(xì)胞生存率明顯小于10x以上稀釋濃度組，差異值有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。10x稀釋濃度以上分組的細(xì)胞生存率與空白對照

6、組差異值無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù) CCK-8結(jié)果計算72小時 IC50約等于5x稀釋濃度?？赏茰y出滲透壓和鎂離子濃度與細(xì)胞生存率呈負(fù)相關(guān)，即滲透壓和鎂離子濃度越高，細(xì)胞毒性越大。
　　2各實(shí)驗(yàn)組ALP活性檢測結(jié)果
　　以不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培養(yǎng)MG-63細(xì)胞1、3、5、7、9天后，隨著培養(yǎng)時間延長，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組的細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)均呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且組內(nèi)不同時間點(diǎn)堿性磷

7、酸酶表達(dá)均有顯著差異（P＜0.05）。同一時間點(diǎn)不同稀釋倍數(shù)的堿性磷酸酶表達(dá)均有顯著差異（P＜0.05）。鎂合金浸提液對ALP的表達(dá)有抑制效應(yīng)，且隨著稀釋倍數(shù)的增大該效應(yīng)逐漸減弱。
　　3各實(shí)驗(yàn)組蛋白總量檢測結(jié)果
　　在干預(yù)第5天時，不同稀釋濃度組的蛋白總量均小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），鎂合金浸提液對蛋白總量的表達(dá)有抑制效應(yīng)，且隨著稀釋倍數(shù)的增大該效應(yīng)逐漸減弱。
　　4各實(shí)驗(yàn)組成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果

8、
　　管家基因GAPDH及目的基因Col-1、OC和OPN mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線可。各個檢測基因均獲得較好的Ct值，且樣品重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)組Col-1、OC與OPN的mRNA的表達(dá)水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5各實(shí)驗(yàn)組Col-1、OC、OPN蛋白表達(dá)檢測結(jié)果
　　以不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，于第5天裂解細(xì)胞收集蛋白。利用蛋白印跡法（western blot）對細(xì)胞內(nèi)C