再生障礙性貧血患者體外共刺激信號阻斷作用的研究及染色體分析.pdf

1、第一部分CTLA-4Ig及抗CD40L單抗對再生障礙性貧血患者體外骨髓T細(xì)胞活化及單個核細(xì)胞細(xì)胞因子誘生水平影響的研究 AA的確切發(fā)病機制至今仍未完全闡明。長期以來，造血干細(xì)胞異常、造血微環(huán)境異常以及細(xì)胞免疫功能紊亂被認(rèn)為是再障的三個主要發(fā)病機制。其中免疫抑制治療對多數(shù)再障患者有確切療效使人們傾向于接受再障是針對造血干細(xì)胞的一種自身免疫性疾病這一觀點。再障研究發(fā)現(xiàn)的諸多細(xì)胞免疫異常如T細(xì)胞亞群的變化（包括CD4/CD8比值降低

2、，Th1/Th2漂移等）以及細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化等也為這一學(xué)說提供了越來越多的證據(jù)。 抗原特異性的T細(xì)胞活化過程中需要抗原信號和共刺激信號分子的雙重作用，阻斷共刺激信號可誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞免疫無能。共刺激阻斷劑用于移植耐受、自身免疫性疾病等的治療，在體內(nèi)、外試驗中已經(jīng)取得比較肯定的療效。 我們在前期關(guān)于再障T細(xì)胞早期激活及共刺激信號分子檢測等研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究用共刺激信號相關(guān)分子CTLA-4Ig、抗CD4

3、0LmAb誘導(dǎo)再障患者骨髓T細(xì)胞免疫無能，一方面加深對再障免疫發(fā)病機制的認(rèn)識；另一方面，為探討上述分子作為免疫調(diào)節(jié)劑治療再障的潛能提供實驗室研究資料。主要內(nèi)容包括運用流式細(xì)胞分析及ELISA方法，研究CTLA-4Ig/抗CD40LmAb對骨髓T細(xì)胞體外增殖、活化及骨髓單個核細(xì)胞體外誘生細(xì)胞因子水平的影響。 目的：CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb分別與B7和CD40L結(jié)合，抑制T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)所必需的共刺激信號的作用，從而誘導(dǎo)

4、T細(xì)胞無能。細(xì)胞免疫異常是再障患者免疫發(fā)病機制的主要方面，因此我們通過流式細(xì)胞術(shù)方法及ELISA方法，測定CTLA-4Ig/抗-CD40LmAb作用前后再障患者骨髓T細(xì)胞表型的變化及單個核細(xì)胞體外誘生細(xì)胞因子水平的變化，從而初步判斷共刺激信號阻斷對糾正再障異常細(xì)胞免疫的可能作用。 材料和方法： 1.再障患者48例，其中重型再障（SAA）20例，非重型再障（NSAA）28例。正常對照16例。 2.無菌抽取患者髂后上

5、棘骨髓8-10ml或胸骨骨髓約5ml，抽取正常對照骨髓5ml，肝素抗凝。 3.密度-梯度法分離骨髓單個核細(xì)胞（BMMNCs）。 4.骨髓單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)： 1）再障患者BMMNCs分為3份：CTLA-4Ig組、抗-CD40LmAb（4F1）組、再障對照組，體外培養(yǎng)5d后，再加入PHA（20μg/ml），培養(yǎng)2d。 2）正常對照組BMMNCs體外培養(yǎng)5d后，再加入PHA（20μg/ml），培養(yǎng)2d。

6、 3）收集細(xì)胞 4）離心取上清，過濾分裝，-20℃保存待檢測。 5.ELISA方法檢測再障三組及正常對照組細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10誘生水平 6.流式細(xì)胞術(shù)分析上述再障三組CD4+/CD8+/CD3+、CD25+、CD4+CD25+和CD8+CD25+表型細(xì)胞的變化。 7.統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果： 1.SAA及NSAA患者骨髓MNC誘生IL-2、IFN-γ水平較正常對照組顯著增高

7、（P<0.05），IL-10水平均較正常對照顯著降低（P<0.05） 2.SAA較NSAA患者骨髓MNC誘生IL-2、IFN-γ水平顯著增高（P<0.05）；但二者誘生IL-10水平無顯著性差異（P>0.05）。 3.CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb均可降低SAA、NSAA患者骨髓MNC培養(yǎng)上清誘生IL-2、IFN-γ水平水平（P<0.05），但較正常對照組仍顯著性增高（P<0.05）； 4. CTLA-4

8、Ig和抗-CD40LmAb均可增高SAA、NSAA患者骨髓MNC培養(yǎng)上清誘生IL-10水平（P<0.05），但較正常對照組仍有顯著性差異（P<0.05）； 5. CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb（4F1）均能夠降低再障（包括重型和非重型）骨髓淋巴細(xì)胞群體中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+、CD4+CD25+、CD8+CD25+細(xì)胞的比值，（P<0.05）。 結(jié)論： 1.CTLA-4Ig及抗-CD40

9、LmAb（4F1）均能夠降低再障患者體外BMMNC誘生IL-2、IFN-γ水平，提高IL-10誘生水平。 2.CTLA-4Ig及抗-CD40LmAb（4F1）能夠降低骨髓淋巴細(xì)胞群體中T淋巴細(xì)胞的比值，抑制再障患者骨髓T淋巴細(xì)胞的異常活化。 3.CTLA-4Ig及抗-CD40LmAb（4F1）能夠降低T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志CD25的表達(dá)，且CD4+、CD8+群體中CD25的表達(dá)均降低。 第二部分再生障礙性貧血患者的細(xì)

10、胞遺傳學(xué)研究 長期以來，造血干細(xì)胞異常、造血微環(huán)境異常以及免疫功能紊亂被認(rèn)為是再障的三個主要發(fā)病機制。在細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)時代之前，血液學(xué)界傳統(tǒng)上以及普遍接受的觀念認(rèn)為，再障不是一種克隆性疾病。再障患者惡性腫瘤發(fā)病率不高也支持這一觀念。然而，近年來不少實驗研究結(jié)果對“再障不是克隆性疾病”的傳統(tǒng)觀念提出了挑戰(zhàn)，認(rèn)為異常的造血克隆可能并非繼發(fā)發(fā)生，而是患者本身所固有的，只有當(dāng)機體免疫受抑后，異常的造血克隆便得以擴展開來。

11、 目的：再障是否是克隆性疾病這一爭論事關(guān)再障的疾病本質(zhì)，且對今后再障的研究方向和診治策略均將產(chǎn)生重要影響。故本實驗應(yīng)用R顯帶技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析，以期驗證再障患者是否存在異常核型。 材料和方法： 1.再障患者25例，其中重型再障（SAA）10例，非重型再障（NSAA）15例。正常對照20例。 2.無菌抽取患者髂后上棘骨髓或胸骨骨髓約5ml，抽取正常對照骨髓2ml，肝素抗凝。 3.直接法（D）

12、 3.1.用0.2％肝素濕潤之針筒抽取骨髓，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)，將骨髓（約為培養(yǎng)法細(xì)胞數(shù)的3～4倍）加入20ml血清瓶中，加生理鹽水至20ml； 3.2加入秋水仙胺37℃溫箱，1小時； 3.3離心，棄上清液； 3.4低滲：加入預(yù)溫的貯存液，輕輕打勻，置37℃30分鐘： 3.5固定：加入固定液固定，離心，配成細(xì)胞懸液，置4℃保存； 3.6氣干法制片后，Giemsa染液染色，水洗，晾干后顯微鏡檢。