LIGHT信號(hào)分子在再生障礙性貧血中的作用.pdf

1、再生障礙性貧血(AA)是由多種病因、多種發(fā)病機(jī)理引起的骨髓造血功能衰竭、造血細(xì)胞數(shù)量減少所引發(fā)的，以貧血、出血和感染為主要癥狀的一組異質(zhì)性疾病。再障發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，以往認(rèn)為再障的發(fā)生與造血干細(xì)胞損傷、造血微環(huán)境缺陷及免疫介導(dǎo)有關(guān)，三種機(jī)制在不同的患者個(gè)體中單獨(dú)或聯(lián)合作用，導(dǎo)致造血功能衰竭。近年來越來越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到細(xì)胞免疫功能紊亂在再障發(fā)病中起著重要作用，已成為再障基礎(chǔ)研究方面一個(gè)最活躍的領(lǐng)域。
　　近年來的研究已發(fā)現(xiàn)AA患者不

2、僅存在T細(xì)胞數(shù)量的異常，其功能和表型也有明顯改變。新近的研究則進(jìn)一步證實(shí)，AA患者體內(nèi)不但淋巴細(xì)胞異?；罨馨图?xì)胞極化明顯異常，Th1表型細(xì)胞比例顯著增多，尤其產(chǎn)生的負(fù)性造血調(diào)控因子如γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α含量升高。在AA小鼠動(dòng)物模型的研究中也同樣證實(shí)其體內(nèi)存在異?；罨牧馨图?xì)胞，使用ATG、CSA及抗IFN-γ或抗TNF-α單抗治療有效，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該類小鼠造血功能衰竭主要與Fas介導(dǎo)的造血干/祖細(xì)胞凋亡有關(guān)，并由此提出獲得性再生

3、障礙性貧血是由T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞針對(duì)自身CD34+造血干/祖細(xì)胞的一種自身免疫性疾病。因此，繼續(xù)深入探討免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
　　共刺激分子LIGHT、HVEM是一對(duì)近年來研究比較多的共刺激分子，LIGHT與HVEM結(jié)合后可促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子及發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。LIGHT/HVEM信號(hào)在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中具有重要作用，是一個(gè)免疫治療的靶分子。
　　最近的研究發(fā)現(xiàn)LI

4、GHT信號(hào)與一些自身免疫性疾病相關(guān)，主要包括關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、腸炎。轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明LIGHT在T細(xì)胞上表達(dá)會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞活化，炎癥反應(yīng)，集中在腸粘膜組織的組織損傷。相對(duì)地，破壞LTβ/LIGHT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自身免疫性疾病動(dòng)物模型中被證實(shí)可減輕炎癥反應(yīng)，LIGHT基因的敲除可以阻止一些T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的進(jìn)展，如胰島素依賴型糖尿病，炎癥性腸病，急性自身腦脊髓膜炎，GVHD。
　　我們利用Peromyscus leucopus.l

5、inville(PLL)成功建立免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ?，利用再生障礙性貧血模型進(jìn)行LIGHT表達(dá)的測(cè)定，并應(yīng)用LIGHT單抗取得了再生障礙性貧血治療的顯著療效，利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)LIGHT基因表達(dá)，使再障發(fā)病進(jìn)程得到改善。同樣的現(xiàn)象我們?cè)谠僬匣颊咧械玫搅蓑?yàn)證，我們通過提取再障患者的外周血淋巴細(xì)胞，觀察LIGHT的表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)再障治療前后，LIGHT表達(dá)有明顯的差異。所以我們的實(shí)驗(yàn)主要探討了LIGHT信號(hào)分子在再生障礙性貧

6、血發(fā)生過程中的作用，并且我們有理由相信LIGHT在再障發(fā)病進(jìn)程中起著重要作用。
　　一.peromyscus leucopus的生物學(xué)特性，及其在造血系統(tǒng)疾病研究中的作用
　　Peromyscus leucopus，是一種有著白色爪子的鼠，是北美地區(qū)最常見的野生鼠種群。它和我們常見的實(shí)驗(yàn)用鼠MMB6從體型及外貌都非常相似。它是人類很多疾病的傳播者。最新對(duì)于Peromyscus.leucopus的研究興趣是因?yàn)檎J(rèn)為這物種可能是

7、研究血液系統(tǒng)疾病的理想動(dòng)物模型，
　　目的:研究Peromyscus leucopus的生物學(xué)特性，了解其外周血象，骨髓象，病理特點(diǎn)，及利用此動(dòng)物進(jìn)行再生障礙性貧血模型建立的研究，以探索其在血液系統(tǒng)疾病研究中的作用，
　　方法:參照文獻(xiàn)方法，將Peromyscus leucopus(PLL)小鼠分成三組，2-6月為年輕組，7-15月為中年組，＞15月為老年組。分別進(jìn)行血常規(guī)、骨髓細(xì)胞、脾臟細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及骨髓、肺、脾臟、肝臟的

8、病理檢測(cè)，予NAC干預(yù)后，檢測(cè)ROS表達(dá)。分離正常父系PLL的淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為20-50×106/L，先接受5GyTBI，從尾靜脈注射入F1代小鼠，通過血常規(guī)、骨髓檢測(cè)，以證實(shí)再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕ⅰ?br>　　結(jié)果:我們檢測(cè)了全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞計(jì)數(shù)，骨髓、脾臟、肝臟和肺臟的病理和外周血流式細(xì)胞檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)Peromyscus.leucopus外周血有更低的血小板計(jì)數(shù)，更接近于人類血小板值，骨髓中更少的巨核細(xì)

9、胞，這可能更適合用于研究人類血小板減少疾病。老年組表現(xiàn)為血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞壓積(Hct)下降，但血小板會(huì)增加，這點(diǎn)與年齡相關(guān)的血象變化，同人類血液變化相似。骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞計(jì)數(shù)較MMB6明顯減低，脾臟重量也顯著小于MMB6，鼠源抗體CD3、CD4、CD8、CD44和CD45R可適用于PLL。PLL的淋巴細(xì)胞適用N—乙?！狶—半胱氨酸(NAC)證實(shí)PLL良好的抗氧化效應(yīng)。通過血常規(guī)、骨髓象證實(shí)，成功建立了免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血模

10、型。
　　結(jié)論:PLL的生物學(xué)特征更接近于人類，尤其是血象表現(xiàn)接近與人類，今后可以將其作為研究血液疾病更好的動(dòng)物模型。
　　二.LIGHT表達(dá)及變化與再生障礙性貧血發(fā)生發(fā)展間關(guān)系的研究
　　目的:研究LIGHT信號(hào)分子在再生障礙性貧血模型中的表達(dá)，及LIGHT單抗在模型中的治療作用。體外阻斷LIGHT的表達(dá)，觀察再障發(fā)病進(jìn)程的改變。
　　方法:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分三組，一組對(duì)照組，小鼠接受5Gy全身照射(TBI)，第二組

11、TBI+淋巴細(xì)胞輸注組（模型組），實(shí)驗(yàn)小鼠接受5GyTBI，并輸注5×106/L父系淋巴細(xì)胞。第三組TBI+淋巴細(xì)胞+LIGHT單抗，實(shí)驗(yàn)小鼠接受5GyTBI，予當(dāng)天接受5×106/L父系淋巴細(xì)胞輸注，并于輸注后d1、2、3、4、5連續(xù)接受100ul/dLIGHT單抗輸注，于第14天進(jìn)行骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)，骨髓、肝臟、脾臟、腸道等病理檢測(cè)。將父系淋巴細(xì)胞進(jìn)行LIGHT基因的RNA干擾，再回輸給F1代小鼠，通過外周血象及骨髓象的改變，觀察再生障

12、礙性貧血發(fā)病進(jìn)程的改變。
　　結(jié)果:TBI+淋巴細(xì)胞輸注組白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞下降明顯，淋巴細(xì)胞比例明顯增高，輸注LIGHT單抗后中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞回升，血小板上升。骨髓細(xì)胞行流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)代表T細(xì)胞活化的CD3+比例在淋巴細(xì)胞輸注組明顯升高，CD3+CD8+比例相較對(duì)照組明顯升高，LIGHT表達(dá)在再障組亦升高，造血干細(xì)胞表達(dá)在淋巴細(xì)胞輸注組顯著降低，而LIGHT組造血干細(xì)胞出現(xiàn)明顯的回升。接受父系淋巴細(xì)胞后，干擾組

13、的血象同正常值相比無(wú)明顯變化，模型組血象明顯下降，以白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板下降最明顯，骨髓病理比較，干擾組造血細(xì)胞可見，骨髓增生活躍，而模型組骨髓增生低下，巨核細(xì)胞減少，脂肪細(xì)胞易見。
　　結(jié)論:LIGHT信號(hào)分子在再障發(fā)病過程中起著重要作用，隨著LIGHT單抗的應(yīng)用和特異性阻斷LIGHT，均發(fā)現(xiàn)再障的血象及骨髓象有所恢復(fù)。
　　三，再生障礙性貧血患者LIGHT分子表達(dá)的變化
　　目的:檢測(cè)正常成人、重型再生障礙性貧

14、血、非重型再生障礙性貧血患者外周血LIGHT的表達(dá)，及再障患者經(jīng)免疫抑制治療前后LIGHT的對(duì)比，觀擦LIGHT的改變同再障療效的關(guān)系。
　　方法:留取我院血液內(nèi)科自2011年4月至2012年2月間確診的再生障礙性貧血患者，共10例，收集再生障礙性貧血外周血，分離獲得淋巴細(xì)胞，流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞上LIGHT的表達(dá)，提取正常對(duì)照、重型再障治療前，經(jīng)ATG治療后3月外周血T淋巴細(xì)胞總mRNA，檢測(cè)活化T細(xì)胞LIGHT分子基因表達(dá)。

15、>　　結(jié)果:重型再障外周血LIGHT分子表達(dá)明顯高于正常對(duì)照，非重型再障，重型再障為25.4±3.4％，非重型再障患者為16.4±4.7％，而正常對(duì)照僅為5.8±1.6％。重型再障患者LIGHT mRNA明顯高于正常組，在治療后3月，出現(xiàn)LIGHT信號(hào)分子的明顯下調(diào)，血象出現(xiàn)恢復(fù)跡象。
　　結(jié)論:LIGHT表達(dá)上調(diào)與再生障礙性貧血的發(fā)生存在相關(guān)性，通過再障患者治療前后LIGHT信號(hào)分子表達(dá)的改變，可以確定LIGHT信號(hào)分子在再障發(fā)