IFN-α對(duì)MMPs及Ⅰ型膠原在TNF-α誘導(dǎo)HSC活化中作用的影響.pdf

1、目的：肝臟纖維化(hepatic fibrosis HF)的特征改變是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)的過(guò)度沉積，其中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stallate cell HSC)的活化[1]。HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，HSC還可分泌TIMPs使ECM的降解減少，導(dǎo)致ECM合成與分解的不平衡進(jìn)一步促進(jìn)了肝纖維化的形成。另一方面ECM也通過(guò)某些機(jī)制影響著HSC[2、3]。在HF過(guò)程中正常的

2、基底膜樣細(xì)胞外基質(zhì)被以Ⅰ型及Ⅲ型膠原為主的纖維型基質(zhì)所替代，這一改變不僅引起肝臟結(jié)構(gòu)的改變，更重要的是可以使HSC激活并維持其活化狀態(tài)[4、5]。炎性因子在纖維化疾病中起到重要作用[6、7、8]，已有研究表明TNF-α可以誘導(dǎo)包埋于Ⅰ型膠原的皮膚成纖維細(xì)胞pro—MMP—2的活化，單獨(dú)的Ⅰ型膠原或TNF-α對(duì)成纖維細(xì)胞pro—MMP—2的活化作用不大[9]，IL1介導(dǎo)的培養(yǎng)于Ⅰ型膠原的HSC的活化需要MMPs的參與，單獨(dú)的IL1或Ⅰ型膠

3、原的作用都不會(huì)引起MMPs的產(chǎn)生及HSC的活化[10]，TNF-α作為一種重要的炎性因子其在促HSC活化中是否需要其它因素的介導(dǎo)還不清楚。另外干擾素作為一種抗纖維化藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)在肝臟處于炎癥活動(dòng)的患者效果好于非炎癥活動(dòng)期的患者，干擾素是否通過(guò)抗炎性因子發(fā)揮其抗纖維化作用還不清楚。本研究通過(guò)觀察TNF-α、Ⅰ型膠原、IFN-α對(duì)體外培養(yǎng)的HSC分泌Ⅰ型膠原(Col—Ⅰ)、MMP—2 mRNA、MMP—14 mRN

4、A及MMP—2蛋白表達(dá)的影響，來(lái)闡述HSC活化及IFN-α抗肝纖維化的部分作用機(jī)制，為臨床肝纖維化的藥物治療提供更多的理論依據(jù)。 方法：1.采用大鼠肝星狀細(xì)胞株(r—HSC99)；主要試劑為干擾素-α—2b(IFN-α2b)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；鼠尾膠、Ⅰ型膠原(Col—Ⅰ)、MMP—2、MMP—14引物；兔抗鼠MMP—2抗體、兔抗鼠β—actin抗體、山羊抗兔抗體。2.體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞系rHSC—99，分別用

5、TNF-α，Ⅰ型膠原，TNF-α和Ⅰ型膠原，TNF-α、Ⅰ型膠原和IFN-α—2b作用4、12、24、36小時(shí)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定各組HSC細(xì)胞Col—Ⅰ mRNA，MMP—2、14 mRNA表達(dá)，采用半定量的方法計(jì)算出各組的相對(duì)含量，應(yīng)用western blotting方法檢測(cè)各組HSC細(xì)胞活化MMP—2蛋白的表達(dá)。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。 結(jié)果：1、各時(shí)間點(diǎn)不同干預(yù)組對(duì)HSC表達(dá)Col

6、—Ⅰ mRNA的影響：Ⅰ型膠原組Col—ⅠmRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯增高，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNF-α、Ⅰ型膠原和IFN-α，2b組Col—ⅠmRNA表達(dá)水平較TNF-α和Ⅰ型膠原組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α，和Ⅰ型膠原組較Ⅰ型膠原Col—ⅠmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、各時(shí)間點(diǎn)不同干預(yù)

7、組對(duì)HSC表達(dá)MMP—2mRNA的影響：TNF-α和Ⅰ型膠原組MMP—2 mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組增高，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α組、Ⅰ型膠原組較正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNF-α、Ⅰ型膠原和IFN-α2b組MMP—2 mRNA表達(dá)水平較TNF-α和Ⅰ型膠原組有降低，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、各時(shí)間點(diǎn)不同干預(yù)組對(duì)HSC表達(dá)MMP—14 mRNA的影響：TNF

8、-α和Ⅰ型膠原組MMP—14 mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組增高，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α組、Ⅰ型膠原組較正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNF-α、Ⅰ型膠原和IFN-α2b組MMP—14 mRNA表達(dá)水平較TNF-α和Ⅰ型膠原組降低，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4、24h各組MMP—2蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原和TNF-α組與Ⅰ型膠原組均可見(jiàn)活化的MMP—2蛋白表達(dá)，IF

9、N-α、TNF-α和Ⅰ型膠原組無(wú)活化的MMP—2蛋白表達(dá)。 結(jié)論：1、Ⅰ型膠原可促進(jìn)HSC的Col—ⅠmRNA的表達(dá)；單獨(dú)的TNF-α對(duì)HSC表達(dá)Col—ⅠmRNA沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。Ⅰ型膠原和TNF-α共同作用可顯著增強(qiáng)Ⅰ型膠原促進(jìn)HSC表達(dá)Col—ⅠmRNA的作用。2、Ⅰ型膠原與TNF-α共同作用可促進(jìn)HSC的MMP—2 mRNA表達(dá)，單獨(dú)的TNF-α或Ⅰ型膠原對(duì)HSC的MMP—2 mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。Ⅰ型膠原可

10、促進(jìn)HSC的活化的MMP—2蛋白的表達(dá)，單獨(dú)的TNF-α無(wú)此作用。3、Ⅰ型膠原與TNF-α共同作用可促進(jìn)HSC的MMP—14 mRNA的表達(dá)；單獨(dú)的TNF-α或Ⅰ型膠原對(duì)HSC的MMP—14 mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。4、 IFN-α可抑制Ⅰ型膠原與TNF-α共同作用引起的HSC的Col—ⅠmRNA、MMP—2 mRNA、MMP—14 mRNA的表達(dá)及Ⅰ型膠原引起的HSC活化的MMP—2蛋白的表達(dá)。這可能是IFN-α發(fā)揮抗肝纖維