腦橋呼吸調(diào)整中樞對黑伯反射和低氧呼吸反應的調(diào)控作用.pdf

1、腦橋呼吸調(diào)整中樞由腦橋背外側(d1-pons)和腦橋腹外側(v1-pons)兩個結構組成。D1-pons的主要結構即KF核及臂旁核(PB)，v1-pons則主要是指A5區(qū)。D1-pons和v1-pons之間存在雙向纖維聯(lián)系。眾所周知，腦橋是呼吸調(diào)整中樞所在地，在呼吸節(jié)律的發(fā)起、呼吸時相轉換以及呼吸運動協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用。本課題試圖通過研究腦橋呼吸調(diào)整中樞對呼吸反射的調(diào)節(jié)作用探討腦橋呼吸運動調(diào)控機制。研究分為五部分：第一部分觀察了某些神經(jīng)

2、遞質(zhì)拮抗劑在d1-pons及v1-pons對黑伯反射(肺牽張反射)的影響；第二部分觀察了它們在d1-pons及v1-pons對低氧呼吸反應的影響；第三部分應用神經(jīng)纖維投射追蹤和免疫組織化學技術觀察了d1-pons和v1-pons神經(jīng)元向腦干呼吸反射(低氧呼吸反應和黑伯反射)相關神經(jīng)元的軸突投射；第四部分觀察了小鼠的黑伯反射，并觀察了NMDA受體對小鼠黑伯反射的影響；第五部分觀察了電刺激v1-pons對黑伯反射的調(diào)控及NMDA受體在該過程

3、中的作用。 1、NMDA、GABA及AMPA受體拮抗劑在d1-pons及v1-pons對黑伯反射的影響實驗在35只成年SD大鼠上進行，氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，巴夫龍(pancuronium bromide)肌松，人工通氣。以膈神經(jīng)放電為觀察指標。電刺激迷走神經(jīng)模擬黑伯反射。電刺激參數(shù)為：強度20-80μA，頻率80 Hz，波寬0.1 ms，刺激時間60 sec。持續(xù)電刺激迷走神經(jīng)首先出現(xiàn)的是強度依賴性的呼吸暫停、膈神經(jīng)放電停止

4、于呼氣相(Srage-1)。隨著刺激的延續(xù)，節(jié)律性膈神經(jīng)放電重新出現(xiàn)，呼吸頻率逐漸加快向基線水平恢復仍然低于基線水平(Stage-2)。刺激停止后出現(xiàn)短暫的呼吸頻率加快并高于刺激前基線水平，該現(xiàn)象主要是由呼氣時間的縮短引起的，稱為刺激后反跳效應(PR，Stage-3)。分別在d1-pons及v1-pons微量注射NMDA受體阻斷劑D-2-氨基-5-膦酸基戊酸(D-AP5，10 mM)、GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline

5、，BIC，5 mM)及AMPA受體阻斷劑CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，10 mM)，注射劑量20-50 nl。以注射前黑伯反射為前對照，觀察注射后黑伯反射的改變。 結果發(fā)現(xiàn)：(1)在dl-pons微量注射AP5可以增強黑伯反射的呼吸抑制效應，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時間延長幅度及吸氣時間縮短幅度均增大；黑伯反射第三階段呼吸頻率仍然低于基線水平，反跳現(xiàn)象

6、消失，該階段吸氣時間增加的幅度明顯增大，上述變化均有顯著性差異。(2)在vl-pons微量注射AP5可以削弱黑伯反射的呼吸抑制效應，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時間延長幅度均減小，黑伯反射第三階段呼吸頻率高于基線水平出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，但比前對照削弱，上述變化均有顯著性差異。(3)在dl-pons微量注射BIC可以削弱黑伯反射的呼吸抑制效應，表現(xiàn)為黑伯反射第一階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時間延長幅度及吸氣時間縮短幅度均減小，

7、第二階段呼氣時間延長幅度及吸氣時間縮短幅度也減小，第三階段呼氣時間縮短的幅度減小，吸氣時間雖比第二階段有所延長但仍低于基線水平，上述變化均有顯著性差異。第三階段呼吸頻率高于基線水平，出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，與前對照相比有所削弱但無顯著性差異。(4)在vl-pons微量注射BIC可以增強黑伯反射的呼吸抑制效應，表現(xiàn)為黑伯反射第一第二階段呼吸頻率下降幅度、呼氣時間延長幅度及吸氣時間縮短幅度均增大，變化均有顯著性差異；黑伯反射第三階段呼吸頻率高于基線水

8、平，出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，與前對照相比有所削弱但無顯著性差異。(5)在dl-pons微量注射AMPA受體阻斷劑CNQX后，黑伯反射三個階段的膈神經(jīng)放電抑制效應無明顯變化；(6)在vl-pons微量注射CNQX后，黑伯反射三個階段的膈神經(jīng)放電抑制效應也沒有顯著改變。這些結果表明存在于dl-pons及vl-pons的由NMDA受體及GABA受體介導的突觸傳遞參與了對黑伯反射強度的調(diào)節(jié)，AMPA受體不影響該過程。 2、NMDA、GABAA及A

9、MPA受體拮抗劑在dl-pons及vl-pons對低氧呼吸反應的影響實驗在35只成年SD大鼠上進行。動物制備同前。低氧通氣為8％O2-92％N2混合氣體，低氧通氣時間30-50秒。以膈神經(jīng)放電為觀察指標，分別向dl-pons及vl-pons內(nèi)微量注射NMDA受體阻斷劑D-AP5、GABA受體阻斷劑BIC、AMPA受體阻斷劑CNQX，觀察注射前后低氧通氣時膈神經(jīng)放電的變化。結果顯示給予大鼠低氧刺激后，膈神經(jīng)放電首先出現(xiàn)頻率升高、吸氣相幅度

10、增大、呼氣時間及吸氣時間均縮短，此謂急性低氧呼吸反應。終止低氧恢復正常通氣后即可出現(xiàn)膈神經(jīng)放電頻率降低并低于低氧刺激前基線水平，此現(xiàn)象稱為低氧后呼吸頻率下降(PHFD)。以微量注射前低氧反應為前對照，(1)在dl-pons微量注射D-AP5后，急性低氧反應膈神經(jīng)放電無顯著性改變，但PHFD期膈神經(jīng)放電頻率下降幅度減小，即PHFD現(xiàn)象被削弱。(2)在vl-pons微量注射D-AP5后，急性低氧反應期及PHFD期膈神經(jīng)放電均無顯著性改變。(

11、3)在dl-pons微量注射BIC后，急性低氧反應期膈神經(jīng)放電頻率升高的幅度及呼氣時間縮短的幅度均增大，PHFD期膈神經(jīng)放電無顯著性變化。(4)在vl-pons微量注射BIC后，急性低氧反應期膈神經(jīng)放電無顯著性變化，但PHFD期呼吸頻率下降幅度減小。(5)在dl-pons微量注射CNQX后，急性低氧反應期膈神經(jīng)放電頻率無明顯變化，但呼氣時間縮短的幅度減小，吸氣時間縮短的幅度增大。PHFD期膈神經(jīng)放電頻率降低的幅度減小。(6)在vl-po

12、ns內(nèi)微量注射CNQX后，急性低氧反應期吸氣時間縮短的幅度增大，但膈神經(jīng)放電頻率及呼氣時間均無顯著性變化。PHFD期膈神經(jīng)放電頻率降低的幅度減小。這些結果表明dl-pons NMDA受體、GABA受體及AMPA受體均參與了對低氧呼吸反應的調(diào)節(jié)，NMDA受體主要影響低氧后呼吸頻率下降，GABA受體主要影響急性低氧反應，dl-pons AMPA受體作用則表較復雜，它既影響急性低氧反應又影響低氧后呼吸頻率下降。vl-pons GABA受體及A

13、MPA受體參與了低氧呼吸反應的調(diào)節(jié)，GABA受體主要影響低氧后呼吸頻率下降，AMPA受體既影響急性低氧反應又影響低氧后呼吸頻率下降，NMDA受體沒有參與該反應的調(diào)節(jié)。 3、Vl-pons與延髓外周化學感受性反射及黑伯反射功能相關神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系實驗在8只成年SD大鼠上進行。腹腔注射苯巴比妥(50 mg/kg)麻醉。在無菌手術條件下應用壓力注射或微電泳方法向d1-pons KF核內(nèi)微量注射Biotin dextran，壓力注射

14、量為20-30 nl(10％)。微電泳注射采用陽極直流電，5μA，15-30分鐘。動物存活10天后給予動物8％的低氧刺激或呼氣末正壓通氣刺激(PEEP)。2-3小時后，腹腔注射氨基甲酸乙酯將動物麻醉，左心室插管灌流、固定，取腦干切片(50μm)，用兔抗c-Fos多克隆抗體(一抗)及結合生物素的羊抗兔IgG(二抗)培育腦片，再用ABC-DAB方法處理腦片，用甲酚紫染色方法染色。結果發(fā)現(xiàn)發(fā)自d1-pons KF核的纖維投射到已知的延髓呼吸相

15、關結構。另外單纖維追蹤顯示KF核神經(jīng)元支配多個結構。c-Fos免疫陽性神經(jīng)元主要分布在孤束核內(nèi)側及腹外側亞核、延髓腹外側的外側網(wǎng)狀核、疑核及其周圍區(qū)域。發(fā)自d1-pons的標記纖維末梢與上述c-Fos免疫陽性神經(jīng)元集中存在的區(qū)域重疊，提示d1-pons投射纖維與延髓中參與外周化學感受器反射及黑伯反射的神經(jīng)元可能存在突觸聯(lián)系。 4、普通野生型及MECP2基因敲除小鼠黑伯反射特點及NMDA受體對其調(diào)節(jié)作用雷特氏綜合癥(Rett綜合癥)是一種

16、嚴重影響兒童精神運動發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，兒童在6到18個月表現(xiàn)正常，隨后病童會有快速退化及發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，并出現(xiàn)陣發(fā)喘氣等呼吸異常現(xiàn)象，大約26％的Rett綜合癥患者死于呼吸功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)該病可能與methy1-CpG結合蛋白2(MECP2)基因的突變有關。 5、電刺激dl-pons及向vl-pons內(nèi)微量注射NMDA受體阻斷劑MK-801對黑伯反射的調(diào)控作用該部分實驗在38只成年Wistar大鼠上進行，雌雄不拘。氨基甲酸乙

17、酯腹腔麻醉，用三碘季銨酚肌松，人工通氣，以膈神經(jīng)放電為觀察指標。電刺激迷走神經(jīng)模擬黑伯反射。Vl-pons電刺激參數(shù)：50-80 μA，80 Hz，波寬0.3 ms，刺激時間20 sec，迷走神經(jīng)電刺激參數(shù)：20-40 μA(1.5×閾值)，80 Hz，波寬0.1 msec，刺激時間60 sec。以電刺激vl-pons之前的黑伯反射為前對照，電刺激vl-pons后5 sec內(nèi)再次電刺激迷走神經(jīng)引導出黑伯反射，發(fā)現(xiàn)與前對照相比，黑伯反射的